【正文】 IgG為例。【實驗原理】 抗原和抗體在液相中反應(yīng)，所形成的免疫復(fù)合物使液相出現(xiàn)濁度，復(fù)合物的量與濁度 呈正相關(guān)。 3．為防止電泳后兩個緩沖槽中緩沖液的pH與離子強度有所改變，每次電泳后應(yīng)更換陰陽電極，或?qū)刹壑械木彌_液混合。 2．抗原抗體比例需適當，抗體過多時清晰的沉淀帶減少；抗原過多會出現(xiàn)弧線融合或消失。臨床上常用于骨髓瘤、γ球蛋白缺乏癥、肝臟疾病、白血病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等患者血清蛋白成分的分析。但免疫電泳技術(shù)的分辨率也受很多因素的影響，如抗原抗體比例、抗血清的抗體譜、以及影響區(qū)帶電泳的各種因素：緩沖液、瓊脂、電流等。 3，如欲制作染色標本，可將瓊脂板浸泡于生理鹽水中24～48h，其間換水2～3次，以除去未反應(yīng)的蛋白，再用蒸餾水浸泡2h除鹽，然后于板上覆蓋用水浸濕的棉布一塊，置于37℃溫箱過夜，使其干燥，再浸入氨基黑染液中染10～20min，用脫色液脫色，保存。 2．若抗原抗體反應(yīng)形成的沉淀線很弱，肉眼難見，可將瓊脂板用生理鹽水浸泡10h (其間應(yīng)換液數(shù)次)，以去除未反應(yīng)的蛋白。待鑒定的提純?nèi)薎gG的沉淀弧應(yīng)主要在γ區(qū)，并可延伸到β區(qū)，甚至α區(qū)。 【結(jié)果分析】 1．觀察已分離的血清抗原成分與相應(yīng)抗體形成的沉淀弧。用毛細滴管加入抗人全血清，充滿槽內(nèi)，勿使外溢。控制電流2～4mA／cm板寬，可終止電泳()。為便于觀察樣品泳動位置可在正常人血清中加微量氨基黑染液。孔徑3mm(可加樣品10μl)，～2mm。凝固后按孔型樣板打孔、開槽。 3．器材 電泳儀、電泳槽、37℃溫箱、恒溫水浴箱、水平臺、載玻片、吸管、3mm打孔器、孔型樣板、尖頭棉簽棒、毛細滴管、手術(shù)刀片、濕盒等。 【器材試劑】 1．標本 正常人血清、待鑒定的人IgG提取液。各區(qū)帶蛋白在相應(yīng)位置與抗體形成弧形沉淀線?！緦嶒炘怼棵庖唠娪?immunoeletrophoresis，IEP)是瓊脂區(qū)帶電泳和凝膠雙擴散相結(jié)合的一種免疫技術(shù)。甲酰化的方法：取待檢血清若干，％甲醛稀釋至分析要求的濃度，室溫30min，即可使蛋白質(zhì)分子中的氨基與甲醛發(fā)生縮合反應(yīng)，該反應(yīng)抑制了蛋白質(zhì)分子中堿性基團的解離，使其形成某種酸。使用低電壓、低離子強度、電泳時間長些，效果會更好。這樣可防止抗原液向孔四周擴散，使火箭峰形狀良好，敏感性增加。 2．應(yīng)選擇電滲作用最小的精制瓊脂粉或優(yōu)質(zhì)瓊脂糖來制備凝膠，而不用普通瓊脂。6．如在抗原標本中加入微量放射性核素，電泳后具有放射性的沉淀帶在暗室中可使膠片感光，感光峰比凝膠中肉眼可見的火箭峰高得多——此法稱火箭電泳放射自顯影，檢測靈敏度可提高40～60倍。 4．用多價抗血清時每個火箭可出現(xiàn)多個子峰；抗原與抗體比例不適合或電泳條件不適當時不出現(xiàn)火箭峰。但抗原濃度過高則在瓊脂板上看不到峰頂；而抗體濃度過高則沉淀峰太低，降低試驗的敏感度。待測樣品的定量可根據(jù)峰高從標準曲線上查出。如欲永久保留，可將瓊脂板進行染色干燥處理。電泳1～2h可見火箭峰的出現(xiàn)。將加樣完畢的瓊脂板置電泳槽的支架上，將打孔加樣端置陰極，用濾紙或紗布條將凝膠板與電泳液相連。另外，向另一板的孔中加入系列已知濃度的陽性血清或其他抗原，用來繪制標準曲線。 3．待瓊脂凝固后在瓊脂板的一端(距板端約5mm)打孔，孔徑3mm，孔間距6～8mm，孔的數(shù)目根據(jù)需要而定。 2．將熔化好的瓊脂置56℃恒溫水浴中預(yù)溫，待溫度平衡(瓊脂膠溫度為56℃)后，將抗AFP抗體加到瓊脂液中，二者比例為1∶30。 3．器材 電泳槽、電泳儀、打孔器、水浴箱、玻璃板、吸管、三角燒瓶和微量加樣器等。 【器材試劑】 1．標本 待檢人血清、陽性血清(臍帶血清)?？乖吭礁?，所形成的火箭峰就越長。泳動中的抗原濃度越來越小，沉淀帶越來越窄，直至全部抗原與抗體結(jié)合，形成一個錐形的沉淀峰。 五 火箭電泳 【目的要求】要求掌握火箭電泳的原理，熟悉其操作方法，了解其應(yīng)用。5．電泳完畢，先斷電源（不僅關(guān)閉電源按鈕，一定要脫開電泳槽和電泳儀之間的連接線，以防積蓄電壓觸電），再取出電泳板。3．電泳時抗原、抗體電極方向不可放反?！咀⒁馐马棥?．澆制瓊脂板的注意事項同瓊脂雙擴散試驗。4．該方法可用于抗原的半定量測定或根據(jù)沉淀線的位置、形狀做抗原和抗體相對濃度的分析。3．對流免疫電泳實際上是電場作用下的瓊脂雙擴散試驗，操作簡便，觀察結(jié)果快，敏感度比瓊脂雙擴散法高8~16倍。 【結(jié)果分析】1．待測孔與抗血清之間出現(xiàn)沉淀線為陽性，否則為陰性。接通電源，~。 3．加樣 做好抗原和抗體的標記（例如在無關(guān)緊要的邊緣打一小孔等），按標記分別加入抗原、抗體及陽性對照?！痉椒ú襟E】1．制板 。2．試劑 AFP診斷血清、 、15g/L瓊脂（ ）。試驗中將抗原放負極，抗體放正極，在一定的時間內(nèi)（約30~90min），移動的抗原與抗體在兩孔間相遇并發(fā)生反應(yīng)，在濃度比例適當時形成沉淀線?！緦嶒炘怼繉α髅庖唠娪緦嵸|(zhì)上是定向加速的電泳技術(shù)與免疫雙擴散技術(shù)的結(jié)合。3．瓊脂熔化后置水浴中保溫時，溫度不可超過56℃，否則會使抗體變性；溫度也不可過低，否則瓊脂易凝固而不能澆制出很好的瓊脂板。2．每批試驗均應(yīng)同步繪制標準曲線。3．本方法比較穩(wěn)定，易于操作；但觀察結(jié)果需時間長，敏感度偏低，每次試驗均需做參考血清的標準曲線。從標準曲線上查得相對應(yīng)的IgG含量，乘以稀釋倍數(shù)，即為待檢血清中IgG的實際含量。6．繪制標準曲線 以各稀釋度工作標準的沉淀環(huán)直徑為橫坐標，相應(yīng)孔中IgG含量為縱坐標，在半數(shù)紙上繪制標準曲線。另外， 蒸餾水溶解，用生理鹽水稀釋成如下濃度：1∶1∶11∶1∶31∶40，分別加入另一套孔中，每孔中加10μl，用于制備標準曲線。4．加樣 將待檢血清用生理鹽水做1∶40稀釋，用微量加樣器取稀釋血清10μl加入相應(yīng)的試驗孔內(nèi)，每份標本加兩孔。孔要打得圓整光滑，邊緣不要破裂，底部不要與載玻片脫離。2．澆板 ，注意澆板要均勻、平整、無氣泡、布滿整張載玻片。【方法步驟】1．瓊脂準備 吸取已熔化瓊脂59ml于三角燒瓶中，置56℃水浴保溫，將預(yù)溫的羊抗人IgG診斷血清1ml與瓊脂充分混合，繼續(xù)保溫于56℃?zhèn)溆谩?．試劑 羊抗人IgG診斷血清（單擴效價1∶60）、15g/L鹽水瓊脂。如預(yù)先用已知不同濃度的標準抗原制成標準曲線，可從已知的標準曲線上查出待檢標本中抗原的含量?！緦嶒炘怼? 將一定量抗體混勻于瓊脂凝膠內(nèi)，凝膠孔中加入抗原，抗原向四周擴散的過程中與凝膠中的抗體發(fā)生反應(yīng)，在抗原與抗體比例合適處形成抗原抗體復(fù)合物，呈現(xiàn)白色沉淀環(huán)。5．為了使沉淀線保持清晰度，可在加樣完畢將瓊脂板置37℃下進行擴散，形成沉淀線后置室溫或4℃冰箱為佳。4．打孔時要小心，勿使瓊脂層脫離載玻片或瓊脂板底層開裂，以免加樣時順裂縫或底部散失。2．緩沖瓊脂的溫度要適宜，溫度過高澆板時易外溢，同時表面蒸發(fā)量大，瓊脂板光潔度差；但溫度過低則瓊脂凝固過快，制板厚度不均勻，表面不光滑。4．此方法簡便易行，結(jié)果穩(wěn)定可靠；但靈敏度低，試驗所需時間長，且只能定性，不能定量，僅適用于大量普查項目。3．陽性結(jié)果多在24h以內(nèi)出現(xiàn)，48h不出現(xiàn)沉淀線可判為陰性結(jié)果。另外，若相臨抗原濃度相等，可出現(xiàn)對稱相融的沉淀線；若不等，沉淀線移向低濃度一邊。若抗原與抗體只含單一的成分則形成一條沉淀線；若含多種成分，可形成多條沉淀線。4．擴散 將加好樣的瓊脂板放入濕盒中（內(nèi)有5mol/L的石炭酸紗布），置室溫或37℃1~2d，于24h和48h各觀察和記錄結(jié)果一次。如用于檢測抗體特異性時，中央孔加抗血清，四周孔加入不同的有關(guān)抗原。臨床常用的孔型為梅花形，中間為抗體孔，四周等距排列6個抗原孔。 【方法步驟】1．澆板 用粗孔吸管吸取熔化的15g/ ,澆注于潔凈載玻片上，要均勻、平整、無氣泡、布滿整個玻片。 2．試劑 羊抗人IgG診斷血清、15g/L鹽水瓊脂等。若同時含有多種抗原抗體系統(tǒng)，根據(jù)抗原與抗體的性質(zhì)、純度和比例的不同，沉淀線的形狀、位置和數(shù)量不一。【實驗原理】 將對應(yīng)的抗原與抗體放在瓊脂凝膠板中的相應(yīng)孔內(nèi)，讓二者在凝膠中自由擴散。2．觀察結(jié)果時將沉淀管平放在眼前，如在沉淀管后面襯以黑紙或手指，使光線從斜上方射入兩液面膠結(jié)處，則能更清楚地看到沉淀環(huán)。3．本試驗常用于抗原的定性試驗，如診斷炭疽的Ascoli 試驗、血跡的鑒別等。 【結(jié)果分析】1．1號試管兩液面交界處出現(xiàn)乳白色沉淀環(huán)，為環(huán)狀沉淀試驗陽性，2號和3號試管為陰性。環(huán)狀沉淀實驗是把可溶性抗原小心加入已含抗體溶液的環(huán)狀沉淀管液面上，當對應(yīng)的抗原與抗體相遇，在二者交界面處可出現(xiàn)乳白色環(huán)狀沉淀物，即為環(huán)狀沉淀陽性反應(yīng)。本試驗的特異性取決于標記用抗血清的特異性，凝集反應(yīng)的強弱取決于抗血清的效價高低，故應(yīng)選用特異性強和效價高的抗血清 實驗三 沉淀反應(yīng) 一 環(huán)狀沉淀實驗 【目的要求】要求掌握實驗原理，熟悉其方法步驟，了解其檢測意義?！窘Y(jié)果分析】 第1格內(nèi)形成白色凝集物，第3格內(nèi)無凝集。3．分別用牙簽混合均勻并不斷搖動玻片，在日光燈下觀察結(jié)果，一般在幾分鐘內(nèi)出現(xiàn)反應(yīng)?！痉椒ú襟E】1．取潔凈玻片1張，將其分為3大格，第1格及第2格先各加1滴抗體標記SPA菌液，第3格加1滴未經(jīng)抗體標記的葡萄球菌菌液。將2%SPA菌穩(wěn)定液與稀釋免疫血清等量混合，置37℃水浴中30min（也可置4℃冰箱過夜）。再將此懸液加熱56℃30min，迅速冷卻，再以PBS洗3次，%—%NaN3的PBS制成10%懸液，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｖ苽溥^程為：選取能產(chǎn)生SPA的金黃色葡萄球菌Cowan I株接種在瓊脂斜面培養(yǎng)基上，37℃孵育18—24h。A群腦膜炎球菌家兔免疫血清（用前經(jīng)56℃30min滅活）。本試驗是反向間接凝集試驗的一種，特異性及敏感性均高，主要用于檢測可溶性微量抗原。 （四）金黃色葡萄球菌A蛋白協(xié)同凝集試驗【實驗原理】 金黃色葡萄的細胞壁成分中，含有一種稱為A蛋白的抗原物質(zhì)（SPA）能與人及多種哺乳動物IgG的Fc段發(fā)生非特異性結(jié)合，因此可利用金黃色葡萄球菌為載體吸附IgG。注意不出現(xiàn)凝集為陽性，出現(xiàn)凝集為陰性?！咀⒁馐马棥咳槟z抗原使用前一定要搖勻。于上述3格每格加HCG致敏乳膠試劑1滴，分別用牙簽混勻后，連續(xù)搖動2～3min后觀察結(jié)果。4．生理鹽水、黑色方格反應(yīng)板、牙簽、毛細滴管、刻度吸管、試管、水浴箱等等。2．抗HCG抗體 與妊娠診斷試劑配套供應(yīng)。圖2－4 間接凝集抑制試驗原理示意圖【實驗原理】 將含有可溶性抗原的待測標本先與已知抗體混合，充分作用后再加入抗原致敏的乳膠顆粒，因抗體已與標本中的可溶性抗原結(jié)合，乳膠顆粒不再出現(xiàn)可見凝集現(xiàn)象。 （三）膠乳凝集抑制試驗在呈陽性反應(yīng)的乳膠集凝試驗中，若先將待測抗原（抗體）與已知的抗體（抗原）混合，隔一定時間后再加入抗原（抗體）致敏的乳膠顆粒，此時，通過觀察原有的陽性試驗結(jié)果是否轉(zhuǎn)陰而得出結(jié)果（圖2－4），此為膠乳凝集抑制試驗（indirect agglutination inhibition test）。3．血凝板、稀釋棒用后均需用體積分數(shù)為10%次氯酸鈉浸過夜；滴管需煮佛10min，然后用水沖凈，再用蒸餾水沖洗，晾干備用。紅細胞經(jīng)醛化后體積略有增大，兩面突起呈圓盤狀。若想長期保存而不溶血，可在致敏前先將紅細胞醛化。取出，置37℃1h后觀察結(jié)果。然后，對照排各孔加1:。出現(xiàn)明顯凝集的血清最高稀釋度即為HbsAg效價，凡效價1:16者需進一步做中和試驗。 表2—1 反向間接血凝試驗加樣程序孔號123456789生理鹽水 待檢血清－陽性血清致敏紅細胞血清稀釋度1:41:81:161:321:64 1:1281:256紅細胞對照陽性對照 37℃h觀察結(jié)果 【結(jié)果分析】不凝集：紅細胞全部下沉，集中于孔底，形成致密的圓點。3．。2．（一般每孔均需捻轉(zhuǎn)10次左右），直至第7孔、第8孔為致敏紅細胞對照。3．“V”型微量血凝板，微量攪拌器，刻度吸管，滴管（40滴/ml）。 圖2－3 反向間接血凝示意圖 【器材試劑】1．1:20抗HBs致敏的醛化紅細胞，純化的1:20抗HBs，待檢血清，稀釋液?！咀⒁馐马棥? 參照反向間接血凝試驗 （二）反向間接血凝試驗【實驗原理】 把純化的抗體吸附于醛化紅細胞上，即制成抗體致敏的紅細胞，它能與相應(yīng)可溶性抗原結(jié)合，出現(xiàn)紅細胞凝集，此即反向間接血凝試驗（reverse indirect hem agglutination test）（圖2—3）。根據(jù)紅細胞凝集的程度判斷陽性反應(yīng)的強弱（圖2－2），以＋＋凝集的孔為滴度終點。【結(jié)果分析】凡紅細胞沉積于管底，集中呈一圓點的為不凝集（一）。第10管不加血清留作對照。3． 將第2管血清與鹽水混合后?！痉椒ú襟E】1． 取小試管10支，排于試管架上。4． “O”抗原的制備： 將傷寒桿菌O901接種于柯氏瓶，37℃培養(yǎng)18～24h，用生理鹽水洗下菌苔配制成每毫升含100億細菌的懸液，置100℃水中2h，離心沉淀，吸取上清液分裝于無菌試管，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。以測定傷寒血清抗體滴度為例敘述如下： 圖2－1 間接血凝試驗原理示意圖 【器材試劑】1． 傷寒桿菌“O”抗原2． 傷寒桿菌O901免疫兔血清?！。ㄒ唬╅g接血凝試驗【實驗原理】