【正文】 ，注射器，載玻片，血球計數(shù)板，豚鼠，家兔等。[目的要求] 1. 掌握E玫瑰花環(huán)試驗的原理及操作方法。凡能與紅細(xì)胞形成E玫瑰花環(huán)的淋巴細(xì)胞簡稱為E花環(huán)形成細(xì)胞。3. 96孔微量反應(yīng)板的清洗將浸泡有75% 乙醇的棉簽放入微量反應(yīng)板的每個孔內(nèi)旋轉(zhuǎn)，用自來水沖洗反應(yīng)板5次，再用蒸餾水沖洗3次以上，置37℃溫箱中干燥。附 錄1. 阿氏液（Alsever）：即紅細(xì)胞保養(yǎng)液枸櫞酸鈉（5H2O） 枸櫞酸（H2O） 葡萄糖 氯化鈉 雙蒸水 加至 100 ml 將以上試劑加熱溶解于雙蒸水中，115℃滅菌10min,4℃保存?zhèn)溆?。凡被已知新城疫陽性血清抑制血凝者，該病毒為新城疫病毒。?2 病毒血凝抑制試驗的操作方法（單位：mL）孔 號123456789101112血清稀釋度1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:1024病毒對照血清對照生理鹽水5050505050505050505050被檢雞血清50505050505050505050504單位病毒505050505050505050505050室溫中靜置 10 min%紅細(xì)胞505050505050505050505050棄去50 結(jié)果觀察++++++++++++++6. 結(jié)果判定：待病毒對照孔（第11孔）出現(xiàn)紅細(xì)胞100%凝集（++++），而血清對照孔（第12孔）為完全不凝集（）時，即可進(jìn)行結(jié)果觀察。4. 自第1孔至12孔各加50mL 4個血凝單位的新城疫病毒液，其中第11孔為4單位新城疫病毒液對照，振蕩混合均勻，置室溫中作用10min 。2. 在96孔微量反應(yīng)板上進(jìn)行，用固定病毒稀釋血清的方法，自第1孔至第11孔各加50mL生理鹽水。從表41看出，該新城疫病毒液的血凝價為1:128，則l:128為1個血凝單位，1:6l:32分別為4個血凝單位，或?qū)?28/4=32，即1:32稀釋的病毒液為4個血凝單位。紅細(xì)胞全部凝集，沉于孔底，平鋪呈網(wǎng)狀，即為100% 凝集（++++），不凝集者（）紅細(xì)胞沉于孔底呈點狀。3. % 雞紅細(xì)胞懸液50mL，在振蕩器上振蕩，室溫下靜置后觀察結(jié)果（表41）。[實驗內(nèi)容及操作方法]（一）血球凝集(HA)試驗 1. 在96孔微量反應(yīng)板上進(jìn)行，自左至右各孔加50mL生理鹽水。2. 生理鹽水，% 雞紅細(xì)胞懸液。 [目的要求]掌握病毒HA和HI試驗的原理和基本操作方法，了解其實用價值。[思考題]1. 溶血試驗中，第5管是什么對照？為什么要設(shè)這些對照？2. 溶血試驗的原理是什么？ 實驗四 病毒的血凝及血凝抑制試驗有些病毒具有凝集某種(些)動物紅細(xì)胞的能力，稱為病毒的血凝，利用這種特性設(shè)計的試驗稱血球凝集(HA)試驗，以此來推測被檢材料中有無病毒存在，是非特異性的，但病毒的凝集紅細(xì)胞的能力可被相應(yīng)的特異性抗體所抑制，即血球凝集抑制(HI)試驗，具有特異性。若液體呈混濁或放置后管底有紅細(xì)胞沉淀為不溶血。按表31加入各成分，搖勻，置37℃水浴30min。3. 補(bǔ)體的制備：將新鮮豚鼠血清（補(bǔ)體）用生理鹽水稀釋成1:20，取1 ml 置56℃水浴30min滅活。[實驗內(nèi)容及操作方法]1. 2% 山羊(或雞)紅細(xì)胞懸液的制備：無菌取山羊(或雞)抗凝血，離心去血漿，沉淀用生理鹽水洗滌3次，每次2000r/min，離心10min，然后去掉上清液，血細(xì)胞泥用生理鹽水配成2% 的紅細(xì)胞懸液。[材料與試劑]1. 試管，試管架，可調(diào)加樣器，滴頭，滴管，注射器，針頭等。[目的要求]1. 通過溶血試驗，掌握抗原、抗體與補(bǔ)體的關(guān)系及作用特點，理解和驗證補(bǔ)體被激活后的溶細(xì)胞作用。補(bǔ)體（Complement）是存在于正常人和脊椎動物血清及組織液中一組具有酶原活性的蛋白質(zhì)，以豚鼠血清中的補(bǔ)體成分較全且活性高。 3. 對流免疫電泳的原理是什么？實驗三 溶血試驗紅細(xì)胞與其相應(yīng)的抗體（溶血素）發(fā)生特異性結(jié)合，當(dāng)加入補(bǔ)體時，抗原抗體復(fù)合物通過經(jīng)典途徑使補(bǔ)體活化，產(chǎn)生膜攻擊作用，最后導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解，發(fā)生溶血反應(yīng)。如沉淀線不清晰，可將瓊脂凝膠板放在濕盒中37℃數(shù)小時或置電泳槽過夜再觀察。5. 結(jié)果觀察：斷電后，將凝膠板置于燈光下，襯以黑色背景觀察。將抗原孔置于負(fù)極端。3. 加樣：一對孔中，一孔加已知（或待測）抗原，另一孔加待測（或已知）抗體。1. 瓊脂板制備：用巴比妥緩沖液配制1%% 瓊脂凝膠板，厚度23mm。二者在兩孔之間相遇，形成肉眼可見的白色沉淀線。（三）對流免疫電泳，抗體球蛋白帶有微弱的負(fù)電荷，在電泳時，由于電滲作用的影響，抗體球蛋白反而向負(fù)極倒退。（3）抗原檢測：兔抗豬IgG與豬血清孔之間有明顯沉淀帶，與其他血清孔之間不形成沉淀帶。待檢血清無沉淀帶或所出現(xiàn)的沉淀帶與陽性對照的沉淀帶完全交叉者判為陰性。 5. 感作：將瓊脂凝膠板加蓋保濕，置于37℃溫箱，2448h后，判定結(jié)果。（3）抗原檢測：將兔抗豬IgG（抗血清）加入中心孔，將待測抗原（豬血清、雞血清、兔血清、牛血清、羊血清等）置于周圍孔中。（2）抗血清效價測定：將豬血清（抗原）加入中心孔，將兔抗豬IgG（抗體）作2倍比稀釋，即 l:1:1:l:11:32等，分別加至周圍孔中。4. 加樣：以毛細(xì)滴管（或加樣器）將樣品加入孔內(nèi)，注意不要產(chǎn)生氣泡，以加滿為度。挑出孔內(nèi)瓊脂凝膠，注意不要挑破孔的邊緣。待溶解的瓊脂溫度降至60℃左右時倒入平皿中，厚度為23mm。本試驗可用已知抗體檢測樣品中的抗原，也可用已知抗原檢測血清樣品中的抗體。絕大多數(shù)可溶性抗原和抗體的分子量在200ku以下，因此可以在瓊脂凝膠中自由擴(kuò)散，所受阻力甚小。物質(zhì)自由運動形成擴(kuò)散現(xiàn)象，擴(kuò)散可以在各種介質(zhì)中進(jìn)行。4. 注意：觀察結(jié)果時，可將一只手放在小試管對測的適當(dāng)位置上遮擋光線，有利于看到白色沉淀環(huán)。3. 結(jié)果判定：510min內(nèi)判定結(jié)果，上下重疊兩液界面上出現(xiàn)乳白色環(huán)者，為炭疽陽性。取其1支，用毛細(xì)滴管將待檢抗原沿著管壁輕輕加入使重疊在炭疽沉淀素血清之上，上下兩液間有一整齊的界面，注意勿產(chǎn)生氣泡。用濾紙過濾23次，使之呈清朗的液體，此即為待檢抗原。(2) 如待檢材料是皮張、獸毛等，可采用冷浸法。以炭疽環(huán)狀沉淀反應(yīng)為例，此反應(yīng)又稱Ascoli氏反應(yīng)。[實驗內(nèi)容及操作方法] （一）環(huán)狀沉淀試驗環(huán)狀沉淀試驗(Ring precipitation test)是最早的沉淀反應(yīng)。4. 禽流感瓊擴(kuò)抗原，禽流感陽性血清，待檢雞血清；兔抗豬IgG，豬血清，雞血清，兔血清、牛血清，羊血清等。2. 生理鹽水，% NaCl溶液，% 石炭酸生理鹽水，巴比妥緩沖液，瓊脂粉等。3. 了解對流免疫電泳的—般原理和操作技術(shù)。[目的要求]1. 掌握炭疽環(huán)狀沉淀試驗的操作方法和結(jié)果觀察。 沉淀反應(yīng)中的抗原稱為沉淀原（Precipitinogen），抗體稱為沉淀素（Precipitin）。2. 結(jié)果判定：在室溫（20℃）下，觀察3060s，凝集者為陽性，不凝集者為陰性。3. 注意：抗原用前充分搖勻，抗原和被檢血清用前應(yīng)放室溫3060min后再進(jìn)行試驗。同時以陽、陰性血清作對照。1. 被檢血清和布氏桿菌病虎紅平板凝集抗原各30mL滴于玻璃板的方格內(nèi)，每份血清各用一支牙簽或火柴棒混合均勻。抗原是布氏桿菌加虎紅制成。8. 注意：對于陽性及可疑的被檢血清需用試管凝集試驗進(jìn)行驗證。6. 平板凝集試驗與試管凝集試驗的關(guān)系見表12。＋：液體混濁，有小的顆粒狀物，即25% 凝集。＋＋＋：有明顯凝集塊，液體幾乎完全透明，即75% 凝集。5. 結(jié)果判定：按下列標(biāo)準(zhǔn)記錄反應(yīng)結(jié)果。3. 作用：混和完畢后，將玻板置恒溫箱中或采用別的辦法適當(dāng)加溫，使溫度達(dá)到30℃左右，35min內(nèi)記錄反應(yīng)結(jié)果。從血清量最少的一格起，用牙簽將血清與抗原混勻，一份血清用一根牙簽。大規(guī)模檢疫時，允許只用兩個血清量作試驗，牛、馬、駱駝用40mL 和20mL ；豬、山羊、綿羊、狗用80mL和40mL。血清用前需放室溫，使其溫度達(dá)20℃左右。對同群中既無臨床癥狀又無凝集反應(yīng)陽性者，馬、豬重檢仍為可疑，判陰性；牛、羊重檢仍為可疑者，可判為陽性，或以補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)核對。2. 結(jié)果判為可疑時，隔23周后采血重做。牛、馬和駱駝的血清凝集價大于或等于1:100，判為陽性，1:50的凝集價判為疑似反應(yīng)（可疑）；豬、綿羊、