【正文】 小室，取其平均值。用凡士林將蓋片底端 (其中的任一端 )封住，頂端作為注入細(xì)胞混合液。 3．玻片小室的制作 取潔凈 (無(wú)油 )的 載玻片，按下圖粘三條透明膠帶，在膠帶上薄涂一層凡士林 (勿涂到小室內(nèi) )，然后用鑷子取兩個(gè)蓋片，分別放在其上，制成兩個(gè)小室。 (4)取此懸液 毫升放另一小試管中然后加 毫升 Hanks 液使成500 倍稀釋的脾細(xì)胞懸液。 (3)沉淀細(xì)胞用 Hanks 液洗 1— 2 次，棄上清后，加 Hanks 液使總量達(dá)5 毫升。將此細(xì)胞懸液經(jīng) 4— 8 層紗布過(guò)濾， 1500 轉(zhuǎn) /分離心 5 分鐘，棄上清。 7. 微量加樣器 8. 指示細(xì)胞懸液，配制方法如下： 10%綿羊紅細(xì)胞 毫升 補(bǔ)體 (新鮮豚鼠血清 ) 毫升 含 5%小牛血清的 Hanks 液 2 毫升 混合后水浴備用 方法： 1．免疫動(dòng)物 取 25%綿羊紅細(xì)胞懸液 1 毫升，無(wú)菌操作注入小鼠腹腔中 2．脾細(xì)胞液的制備 (1)小鼠免疫 4 天后，頸椎脫位處死，取脾臟，去除脂肪組織，放平皿內(nèi)，用冷 Hanks 液洗 1— 2 次。 材料： 1. 20— 22 克健康小鼠 2. 解剖器械 3. 注射器，平皿，漏斗，紗布，研缽 4. 20%綿羊紅細(xì)胞懸液 5. 潔凈脫脂載玻片 (75ⅹ 25 毫米 )，蓋 玻片 (22ⅹ 22 毫米 )。 綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)一 抗體產(chǎn)生細(xì)胞的檢測(cè) —— 溶血空斑實(shí)驗(yàn) (綜合性實(shí)驗(yàn) ) 取綿羊細(xì)胞免疫的小鼠脾臟，制成脾細(xì)胞懸液，與一定量的指示細(xì)胞(綿羊細(xì)胞 )和補(bǔ)體結(jié)合，注入自制的小室內(nèi)，經(jīng) 37℃孵育后，單個(gè)散在的抗體形成釋放抗體，抗體與周?chē)木d羊紅細(xì)胞 (抗原 )結(jié)合，并在補(bǔ)體參與下，使綿羊細(xì)胞溶解，結(jié)果在抗體形成細(xì)胞周?chē)纬扇庋劭梢?jiàn)的圓形透明溶血區(qū) —— 溶血空斑。加 2M 碳酸1 滴終止反應(yīng)。 3．加酶聯(lián) A 蛋白 于每孔加酶聯(lián) A 蛋白各 毫升，置 37℃ 20 分鐘，洗滌 3 次。 2．加待測(cè)血清 于每孔內(nèi)分別加不同稀釋度 (如 1： 5， 1： 10， 1： 20? 1： 80)的待測(cè)血清， PBS 空白對(duì)照，陰性對(duì)照血清，陽(yáng)性對(duì)照血清各 毫升。 材料： 1. 聚乙烯塑料反應(yīng)板 ( 時(shí)可吸附蛋白 Ag) 2. 抗原：傷寒桿菌 O901 煮沸或超聲波粉碎抗原 3. 待測(cè)血清 4. 凍干酶聯(lián)葡萄球菌 A 蛋白 (HRD— proteinA)純品 5. 鄰苯二胺 (OPD) 6. 包被液： 碳酸鈉 — 碳酸氫鈉溶液 7. 稀釋液： 10%免疫血清 PBS— 吐溫 20，防止非特異性吸附 8. 洗滌液： , 防止非特異性吸附 9. 底物溶液： 磷酸氫二鈉 毫升 檸檬酸 毫升 蒸餾水 50 毫升 臨用前新鮮配制，在上述緩沖液中溶解 40 毫克鄰苯二胺，然后加入30%雙氧水 毫升，底物對(duì)光敏感，需要避光并立即使用。ELISA 法原理如下，見(jiàn)圖 9 圖 9 ELISA－ SPA 法原理 1. 加抗原 使之吸附于固相載體 (如塑料反應(yīng)板 ) 2. 洗滌 加待測(cè)血清 3. 洗滌 加酶標(biāo)記 SpA 4. 洗滌 加酶的底物。常用的是 ELISA 方法，間接法，雙抗體法和抗原法。 實(shí)驗(yàn)七 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA)測(cè)定傷寒桿菌“ O”抗體 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是用酶標(biāo)記的抗體 (或 SPA)檢測(cè)未知抗原或抗體的方法。向懸液中滴一滴美蘭液，混合， 10 分鐘后取一滴放載玻片上，加蓋玻片鏡檢。 3. 500 轉(zhuǎn) /分離心 5 分鐘，放 4℃冰箱中 2 小時(shí)后，棄大部分上清。 圖 8 用分層 液離心后的血細(xì)胞層 2. 加吸收過(guò)的胎牛血清 毫升， %兔紅細(xì)胞懸液 毫升，于淋巴細(xì)胞中。加于 3 毫升淋巴細(xì)胞分層液液面之上 (沿管壁輕輕加入，勿使兩液相混 )。 4. Hanks 液 5. 豚鼠抗凝血 6. 淋巴細(xì)胞分層液 7. 滅菌注射器，針頭，試管，吸管等。目前，已廣泛應(yīng)用于臨床，作為測(cè)定人群免疫狀態(tài)的一個(gè)指標(biāo)。由于人類(lèi) T淋巴細(xì)胞表面具有與綿羊紅細(xì)胞結(jié)合的受體，能與綿羊紅細(xì)胞非特異性結(jié)合，形成E 花環(huán)，因此， T 細(xì)胞也成為紅細(xì)胞花瓣形成細(xì)胞。是測(cè)定淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能的一種方法。沉淀于管底的 E— 花環(huán)，用Hanks 液洗一次后，加雙蒸水 3 毫升處理 3 分鐘，低滲裂解 E— 花環(huán)周?chē)?RRBC，立即加 %氯化鈉溶液 1 毫升，使還原為等滲，低速離心沉淀，即得富含 T 淋巴細(xì)胞群。 3. AET— E 花環(huán)試驗(yàn)： 將分離的單個(gè)核細(xì)胞 (2ⅹ 106/毫升 )與等量 1%AET— RRBC 混合，置37℃水浴 15 分鐘，每隔 5分鐘搖勻一次，分裝數(shù)管，每管 2— 3 毫升，低速離心 (1000 轉(zhuǎn) /分鐘 )5 分鐘后，移至 4℃冰箱 45 分鐘。 (3).1%AET— RRBC 的配制： 將預(yù)先配制并保存于 4℃冰箱的 10%濃度的 AET— RRBC，以含 10%小牛血清的 199 培養(yǎng)液稀釋至 1%。連續(xù)洗滌 3— 5 次，每洗一次，必須充分搖勻，以減少 AET—RRBC 粘附成團(tuán)，并觀察有無(wú)溶血。 (2). AET 處理 RRBC 取洗滌好壓積的 RRBC，按一份壓積 AET— RRBC 加入 4 份新鮮配制的 的 AET溶液充分混勻置 37℃水浴 15 分鐘，每隔 5 分鐘搖勻一次。 方法： 1. AET— RRBC 制備 (1). AET 溶液的制備 稱(chēng)取 AET 粉劑 402 毫克，溶于 10 毫升蒸餾水中，使成為 溶液，用 4N NaOH 溶液調(diào) 。再經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液 分離時(shí)， AET— E 花環(huán)易沉于管底，而未形成 E— 花環(huán)的 T淋巴細(xì)胞，用低滲液解花環(huán)周?chē)? AET— SRBC，便可獲得純 T 淋巴細(xì)胞，而 B 淋巴細(xì)胞可直接取自分層液的界面。 實(shí)驗(yàn)五 T、 B 淋巴細(xì)胞分離試驗(yàn) 淋巴細(xì)胞主要分 T 淋巴細(xì)胞和 B 淋巴細(xì)胞兩大亞群，它們具有不同的特性和功能，為此在進(jìn)行某些免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先需分離出純的 T淋巴細(xì)胞和 B 淋巴細(xì)胞。又如試管、吸管不清潔，也可出現(xiàn)抗補(bǔ)體。 (3) 抗原的滴定 在用已知抗原測(cè)定未知抗體時(shí)，必須先滴定抗原效價(jià)以決定本試驗(yàn)時(shí)所需抗原的最適濃度 (反之用已知抗體測(cè)定未知抗原時(shí)，則需滴定抗體效價(jià) ) 試 管號(hào) 劑 123456 1： 5 稀釋血清 －－－ 傷寒抗原 －－ －－ 痢疾抗 原 1： 80－ －－－－ 補(bǔ)體 生理鹽水－－ 搖勻放置 37℃水浴中 30min 溶血素 － 2％羊血球 搖勻放置 37℃水浴中 15min 說(shuō)明試驗(yàn)管特異性對(duì)照血清 對(duì)照抗原 對(duì)照溶血素對(duì)照羊血球?qū)φ? 如血清對(duì)照管呈完全或部分不溶血是為抗補(bǔ)體現(xiàn)象。 (2) 補(bǔ)體單位滴定 依下表加入各試劑： 管 號(hào)補(bǔ)體 (1： 20)(ml)抗原 (ml)生理鹽水 (ml)置 于 37 ℃ 水 浴 45 分鐘溶血素 (2 單位 )(ml)2%羊血球懸液 (ml)置 于 37 ?℃ 水 浴 15 分鐘結(jié)果 不溶血 稍溶血 全溶血 全溶血 全溶血 全溶血 全溶血 不溶血 能引起完全溶血的最小補(bǔ)體量稱(chēng)為準(zhǔn)確單位，上表中第 3 管 (即 毫升 )，但因補(bǔ)體的效價(jià)可能有部分損失，故普通稍高的一管為實(shí)用單位，實(shí)際試驗(yàn)時(shí)須用兩個(gè)實(shí)用單位。 (1) 溶血素效價(jià)的滴定 按照下表加入各物 管號(hào)溶血素 (ml)溶血素 稀釋倍數(shù) 1： 20 補(bǔ)體 (ml)生理 鹽水 (ml)2%羊血球 (ml) 假定結(jié)果 ： 搖勻后置 37℃水浴一小時(shí) 全溶解 ： 全溶解 ： 全溶解 ： 全溶解 ： 全溶解 ： 全溶解 ： 全溶解 ： 全溶解 ： 全溶解 ： ： ： 對(duì)照 凡最高稀釋度的溶血素可呈現(xiàn)完全溶血者為一個(gè)單位。 材料： 1. 抗原：傷寒的抽出液 2. 抗體：傷寒桿菌的免疫血清 3. 補(bǔ)體：豚鼠血清 4. 溶血素：抗綿羊血細(xì)胞的兔血清 5. 2%綿羊紅血球 6. 小試管、試管架、水浴鍋。 由于參與本反應(yīng)的各種成分間有著一定量的關(guān)系，因此在作本試驗(yàn)之前，必須通過(guò)一系列的預(yù)備實(shí)驗(yàn)來(lái)確定各成分的使用量，故本反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方法較為復(fù)雜。參與補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)的抗原是透明的溶液，故補(bǔ)體結(jié)合現(xiàn)象不能被肉眼看 出來(lái)，因此必須借助溶血系統(tǒng) (溶血素及相對(duì)應(yīng)的羊血球 )作為指示劑，來(lái)判定媒質(zhì)中有無(wú)游離的補(bǔ)體，近而推定媒質(zhì)中未知抗原 (或抗體 )和已知抗體 (或抗原 )是否進(jìn)行了特異性的結(jié)合。 方法： 1．取小試管 3 只，按下表加入各物 (容量單位為毫升 ) 試管 2%紅血球溶血素 (2 單位 )補(bǔ)體 (2 單位 )生理鹽水結(jié)果 —— —— 2．將上述 3 試管放在 37℃水浴箱內(nèi) 15— 30 分鐘觀察有無(wú)凝血現(xiàn)象。 2. 抗體：溶血素 3. 補(bǔ)體：取健康豚鼠血清作為補(bǔ)體。溶血反應(yīng)是由于抗原 (紅血球 )和抗體 (溶血素 )進(jìn)行特異性的結(jié)合，并吸著了補(bǔ)體，而使紅血球在補(bǔ)體的作用下被溶解，于是產(chǎn)生了溶血現(xiàn)象。 溶菌反應(yīng)只在某些細(xì)菌中出現(xiàn) (如霍亂弧菌 )。 實(shí)驗(yàn)四 溶血反應(yīng)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn) 一．溶血反應(yīng) 免疫血清與其相應(yīng)的抗原細(xì)胞 (血球、細(xì)菌 及其組織細(xì)胞相遇，并在補(bǔ)體的參與下可出現(xiàn)溶細(xì)胞反應(yīng)。 4. 重復(fù)吸收過(guò)的上清夜分別與稀釋腸炎桿菌及傷寒桿菌菌液進(jìn)行玻片凝集。 3. 將吸收過(guò)的上清夜與稀釋腸炎桿菌菌液做玻片凝集，觀察結(jié)果。 方法： 1. 1/10 稀釋傷寒桿菌免疫血清分別與腸炎桿菌與傷寒桿菌進(jìn)行玻片凝集，可見(jiàn)傷寒免疫血清與兩種菌均有凝集，說(shuō)明二菌具有共同抗原結(jié)構(gòu)，故發(fā)生交叉凝集反應(yīng)。 2. 菌液：腸炎桿菌菌液，傷寒桿菌菌液。 利用凝集吸收試驗(yàn)可制備單價(jià)因子血清，以進(jìn)行細(xì)菌抗原結(jié)構(gòu)的分析及鑒定菌型。用一種過(guò)量的細(xì)菌抗原與發(fā)生交叉凝集反應(yīng)的抗血清相結(jié)合。 三．凝集吸收 腸道桿菌中的許多細(xì)菌都有部分相同的抗原結(jié)構(gòu)。 ?滴一滴致敏葡萄球菌懸液于玻片上，用接種環(huán)取傷寒 O 菌培養(yǎng)物少許置于懸液中使成均勻孔狀，觀察約 2 分鐘，記錄有無(wú)凝集。 3．協(xié)同凝集試驗(yàn) ?取傷寒“ O”可溶性抗原一滴致敏葡萄球菌懸液，一滴在載波片上混勻，觀察約 2 分鐘。 2．致敏葡萄球菌： 1 毫升 10%的菌懸液加 毫升傷寒 O 抗血清充分混合放入 37℃水浴中 30 分鐘 (中間需搖動(dòng)兩次 )。置于 80℃水浴中 4 分鐘以破壞菌體的自源性分解酶。在以凝集反應(yīng)中，金黃色葡萄球菌菌體成了 IgG 抗體的載體 ,稱(chēng)為協(xié)同凝集反應(yīng) .本反應(yīng)也可用于檢測(cè)微量抗原 . A. 材料： 1. 抗原 :可溶性傷寒桿菌 O 抗原 2. 免疫血清：傷寒桿菌 0901 免疫兔血清 3. 10%CoWan1 株金黃色葡萄球菌 (含大量蛋白 A)的菌液 4. %甲醛 PBS，吸管、滴管、玻片等 B. 方法： 1． 10%葡萄球菌菌懸液的制備： CoWan1 株葡萄球菌接種于柯氏瓶，37℃培養(yǎng) 1824 小時(shí)，用 PBS 洗下菌苔，每分鐘 2500 轉(zhuǎn)速度離心 20分鐘。 (三 )協(xié)同凝集試驗(yàn) 金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁成分中的 A 蛋白能與人及多種哺乳動(dòng)物 (豬、兔、羊、鼠等 )血清中 IgG 類(lèi)抗體 的 Fc 段結(jié)合。 注意事項(xiàng)： 1．試驗(yàn)材料用具用前使溫度接近室溫 (20℃左右 ) 2．被檢尿太混濁，需要小心過(guò)濾。 3．滴加一滴膠乳抗原，緩慢搖動(dòng) 3— 5 分鐘，在較強(qiáng)光線下，觀察結(jié)果。 材料： 1．抗原：吸附有人類(lèi)絨毛膜促性腺激素的聚苯乙烯抗原 2．抗體：抗人類(lèi)絨毛膜促性腺激素抗體血清 3．被檢材料：孕婦尿 4．正常尿作對(duì)照用 5．黑反應(yīng)板 1 塊 6．滴管 3 只 方法： 1．用 清潔滴管在反應(yīng)板上滴加一滴被檢尿。反之，被檢尿中絨毛膜促性腺激素含量甚少 (非妊娠尿 )不足以把加入的抗體消耗，當(dāng)膠乳抗原加入后，抗體便與抗原結(jié)合發(fā)生反應(yīng)。因此當(dāng)往尿中加入抗絨毛膜促性腺激素抗體時(shí) ，由于發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的結(jié)果，抗體