【正文】 （3）孵育：（E ：T＝100 :1）加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，設(shè)3復(fù)孔，同時設(shè)靶細(xì)胞自然釋放孔（＋ 10％FCSRPMI。（2）效應(yīng)細(xì)胞制備：將小鼠頸椎脫位處死，用酒精棉球消毒腹部，剪開腹部皮膚和腹膜，無菌取脾臟，出去脂肪膜等，放入加有約5ml PBS液的平皿中，用5ml 注射器抽取平皿內(nèi)液體緩緩注入脾臟內(nèi)，將脾細(xì)胞沖洗出來。 操作流程（1）靶細(xì)胞制備：取傳代培養(yǎng)24～28小時對數(shù)生長期的YAC1細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)液洗滌2次1000r/min 離心5分鐘。（7）靶細(xì)胞：YAC1細(xì)胞株、小鼠NK細(xì)胞敏感株。（5）1mol/L枸櫞酸終止液：。 （3）LDH底物溶液（臨用前配制）： NBT（硝基藍(lán)四氮唑） 4mgNAD＋（氧化型輔酶Ⅰ） 10mg PMS（吩嗪二甲酯硫酸鹽） 1mg 加蒸餾水2ml溶解，加1mol/，然后加入PBS（）至10ml。12H2O ，KCl ，加去離子水至1000ml溶解。釋放出來的LDH再催化乳酸的過程中，使氧化型輔酶?Ⅰ（NAD＋）變成還原型輔酶（NADH2），后者再通過遞氫體－吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）還原碘硝基氯化氮唑藍(lán)（INT）或硝基氯化四氮唑藍(lán)（NBT）形成有色的甲基化合物，再490nm或570nm波長處有一吸收峰，利用讀取的A值，即可測得殺傷細(xì)胞毒活性。二．乳酸脫氫酶釋放法實驗原理 乳酸脫氫酶（LDH）存在于細(xì)胞內(nèi)，正常情況下，不能透過細(xì)胞膜。 （2）效靶細(xì)胞比率一般選擇50~100：1，其自然殺傷率不再呈對數(shù)增加，標(biāo)本用量過大。 （5）計算：根據(jù)下式計算51Cr自然釋放率和NK細(xì)胞毒活性： 51Cr自然釋放率（%）=（自然釋放孔cpm值）/（最大釋放孔cpm值）100% NK細(xì)胞毒活性（%）=（試驗孔cpm值自然釋放對照孔cpm值）/（最大釋放對照孔cpm值自然釋放對照孔cpm值）100% 4．操作關(guān)鍵 （1）靶細(xì)胞的質(zhì)量非常重要，用臺盼藍(lán)拒染色法檢測K562靶細(xì)胞的存活率應(yīng)＞95%。37度，5% CO2孵育4小時。（2）效應(yīng)細(xì)胞制備：淋巴細(xì)胞分層液分離人PBMC，10%FCSRPMI1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度1107/ml（3）加樣：（E：T=100：1）加入96孔培養(yǎng)板內(nèi)，3復(fù)孔。10% FCSRPMI1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度1105/ml，同時檢測細(xì)胞的51Cr標(biāo)記率，一般要求標(biāo)記率＞。~（100~200uCi）51Cr,5%CO2,37度孵育90分鐘，每個15分鐘振搖一次。（5）靶細(xì)胞：K562細(xì)胞株、人NK細(xì)胞敏感株。（2）%臺盼藍(lán)染色液：，加生理鹽水100ml。51Cr輻射γ射線，通過測定受損傷或死亡靶細(xì)胞釋放到培養(yǎng)上清中51Cr的放射計數(shù)率（cpm），即可推算出NK細(xì)胞活性。Na51Cr ，當(dāng)其進(jìn)入增殖期靶細(xì)胞內(nèi)，可與胞漿內(nèi)的大分子物質(zhì)（如蛋白質(zhì)）結(jié)合，是靶細(xì)胞被標(biāo)記。常用的放射性核素有51Cr、3HDr、125IUdR等。圖13每張玻片記數(shù)200—400個細(xì)胞，計算轉(zhuǎn)化率其中頭部50—100，體部50—100，尾部100—200細(xì)胞。（8） 計算淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率：油鏡下觀察每張玻片的頭、體、尾三段。（6） 1000rpm離心5分鐘。振蕩培養(yǎng)瓶。培養(yǎng)過程中，每天翻動培養(yǎng)瓶12次。（3） 按每毫升營養(yǎng)液加30ugPHA加入PHA。用199培養(yǎng)液將沉淀的白細(xì)胞配成1ⅹ107/毫升細(xì)胞懸液。計算白細(xì)胞數(shù)然后2000rpm離心10分鐘。紅細(xì)胞沉淀后，吸取血漿層并捎帶些紅細(xì)胞。方法：（1） 采肝素抗凝血1—2毫升（1毫升血中加肝素20單位）充分混勻。材料：（1） 肝素（每毫升含100單位）（2） 199培養(yǎng)液（內(nèi)含20%滅活小牛血清。轉(zhuǎn)化率顯然降低?？赊D(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞。 120%以下皆為刺激，刺激反應(yīng)的產(chǎn)生可能是抗原濃度偏低。5． 取出凹玻片，用解剖顯微鏡測定各毛細(xì)管白細(xì)胞移動的扇面之長短直徑。試驗組用199培養(yǎng)加適量抗原作培養(yǎng)液，對照組只用199液作培養(yǎng)液，不加抗原。用小砂輪在毛細(xì)管壁的細(xì)胞——液體界面處劃痕，小心折斷。3． 將毛細(xì)管空端經(jīng)火焰封固端朝下置試管中，于水平離心機(jī)內(nèi)1000轉(zhuǎn)/5，10分鐘。7． 淋巴細(xì)胞提取液8． 離心機(jī)、試管、滴管等。4． 細(xì)胞培養(yǎng)液：199培養(yǎng)液或1640培養(yǎng)液。2． 豚鼠抗凝血清3． 毛細(xì)玻璃管：~1mm。材料1． 抗原：抗原種類因?qū)嶒災(zāi)康牟煌x定，用細(xì)胞培養(yǎng)液配成一定濃度供使用。將有特異細(xì)胞免疫（致敏）人的白細(xì)胞（包括各種白細(xì)胞）裝入毛細(xì)玻璃管中培養(yǎng)，24小時后，白細(xì)胞從管中向外移動呈扇狀，若培養(yǎng)液加入相應(yīng)的抗原，能使致敏T細(xì)胞放出LIF，白細(xì)胞就不能或不能充分從管中向外移動。人體多采用LMIF檢查。欲知人或動物是否存在對某種抗原的致敏T細(xì)胞——特異的細(xì)胞免疫反應(yīng)，可將其淋巴細(xì)胞與抗原一起培養(yǎng)，從有無MIF或LIF產(chǎn)生來做判斷。其中有抑制單核，巨噬細(xì)胞移動的因子（MIF）及抑制多型核白細(xì)胞移動的因子（LIF）。塑料板法的優(yōu)點為操作簡便，節(jié)省材料，適用于大規(guī)模血清學(xué)試驗之用。3. 血凝抑制試驗：將試驗血清按下表稀釋，首先按表滴數(shù)加生理鹽水，然后加入第第2及第3孔以試驗血清，用小號螺旋圈順次稀釋。下表內(nèi)的單位為滴數(shù)。三．微量血凝及血抑試驗方法：1. 滴定血凝效價：先用定量滴頭按下表，第1孔加8滴，其余每孔加2滴，然后用大號螺旋圈吸滿病毒液順次稀釋至第10孔。若血凝單位為1：320，故抗原稀釋度應(yīng)為1：80，故含4單位應(yīng)為1：40。不凝集，血球沉于孔底中心，呈一致密的圓點，光滑圓潤。++約有50%血球凝集，血球在孔底形成環(huán)狀，四周有小凝集塊。各孔凝集結(jié)果以+++，++，+，表示++++全部血球凝集，一層紅細(xì)胞均勻鋪于孔底，呈顆粒狀薄膜，邊緣不整齊。凡出現(xiàn)凝集者，血球沉于孔底呈平鋪象倒張的傘狀，邊緣有卷起的趨向。材料： 1. 新城雞瘟病毒2. %雞紅細(xì)胞3. 抗雞瘟病毒血清4. 生理鹽水、大孔塑料板、小孔塑料板5. 稀釋棒：(用于血凝)，（用于血凝抑制）6. 定量滴頭：1ml注射器上加16號針頭。其中以雞、豚鼠、人的紅細(xì)胞應(yīng)用得最多。病毒導(dǎo)致紅細(xì)胞凝集的原因還不十分清楚，但對流感病毒的血凝一般解釋為病毒包膜上的血凝素，作用于紅細(xì)胞表面的受體而產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。 實驗三 血球凝集和血球凝集抑制試驗病毒的血清學(xué)反應(yīng)與其他微生物的血清學(xué)反應(yīng)相同，即可已知抗原測未知抗體或用已知抗體測未知抗原。即可由橫坐標(biāo)等于1的一點，在直線上求得在縱坐標(biāo)上相應(yīng)的截距，此即產(chǎn)生50%溶血的待測血清實際用量。在雙對數(shù)坐標(biāo)紙上，以ｙ／（１─y）值為橫坐標(biāo)，血清用量為縱坐標(biāo)，得到一條直線。即為測定管的校正ＯＤ值。⑷測定各管上清液ＯＤ值（波長＝５４０ｎｍ）４．補(bǔ)體ＣＨ５０單位的計算從測定管（第１～５管）及溶血對照管（第６管）的ＯＤ值中減去紅細(xì)胞對照管（第７管的ＯＤ值。置37℃水浴中６０分鐘（搖動１～２次，以免紅細(xì)胞下沉。置37℃水浴中作用３０分鐘，每隔10分鐘搖動一次以免細(xì)胞下降即成510８／ml致敏羊紅細(xì)胞。２．致敏綿羊細(xì)胞取綿羊紅細(xì)胞懸液（110２／ml）加等量的溶血素（２U／ｍｌ）。按下式求出于一定體積的5%細(xì)胞懸液中應(yīng)加入稀釋液的毫升數(shù)。2．綿羊紅細(xì)胞懸液（110g/ml）3．溶血素（2U）4． 被檢血清（新鮮豚鼠血清）5． 水平離心機(jī)6． 水浴箱7． 721型分光光度計方法：1．濃度為110g/ml的綿羊紅細(xì)胞配制取經(jīng)稀釋洗滌后的綿羊紅細(xì)胞配成較5%稍濃的細(xì)胞懸液。經(jīng)高壓滅菌后即可使用。50%溶血試驗定血清中補(bǔ)體含量用以下公式表示：該公式可以從Von Krogh 方程式進(jìn)一步加以論證： 假定X=加入的新鮮血清量 y=溶血的百分率，以小數(shù)表示 V=斜率 k=常數(shù)轉(zhuǎn)變成對數(shù)，上述公式就變成當(dāng)以50％溶血作為終點時，代入上述公式，由于－log1＝0，也即表示補(bǔ)體的50％溶血單位就是加入的新鮮血清量。因此當(dāng)補(bǔ)體用量稍有變動，就可對溶血程度發(fā)生很大影響。溶血百分?jǐn)?shù)1009080706050403020100 1 2 3 4 補(bǔ)體量 圖12由溶血素致敏洋紅細(xì)胞的溶血程度與腸鼠血清（補(bǔ)體）量增加之間的關(guān)系以補(bǔ)體量作為橫坐標(biāo)，溶血百分?jǐn)?shù)作為縱坐標(biāo)，可得到一個清晰的“S”形曲線。如用復(fù)紅（紅色），美藍(lán)（蘭色）放入動物罐中。注入菌液1毫升后將針頭退出。3. 以無菌鑷子取碘酒棉球，消毒小白鼠左下腹部，用鑷子取去注射器針頭上的棉花包放入消毒罐中。附：小白鼠腹腔注射法1. 用消毒好的注射器，按無菌操作法抽菌懸液后，再用無菌鑷子夾一滅菌棉花包，將針頭刺入棉花包內(nèi)，排出注射器內(nèi)的氣泡，然后將注射器平擔(dān)于試管架上。結(jié)果觀察：雞紅細(xì)胞呈橢圓，有細(xì)胞核，經(jīng)染色后胞漿呈粉紅色，核呈紫藍(lán)色。3．血球注入后經(jīng)30分鐘至1小時后，用毛細(xì)管取腹腔液制成涂片，待干后用瑞氏染液染色鏡檢。方法：1．48～72小時以前無菌漿糊1ml注入小白鼠腹腔內(nèi)。結(jié)果觀察：細(xì)菌及細(xì)胞核呈深蘭色，細(xì)胞漿呈淡蘭色，在不同時間的涂片中，可看到處于不同階段的吞噬現(xiàn)象。經(jīng)5ˊ、10ˊ、20ˊ、40ˊ后，分別取腹腔液滴于玻片上制成涂片，經(jīng)自然干燥后，用稀釋的美藍(lán)液染色一分鐘后鏡檢。2． 將1ml甲型鏈球菌菌液注入小白鼠腹腔。方法：1． 試驗前3—6小時。將兩支小試管放37℃水浴箱保溫30分鐘。2．唾液流入無菌平皿內(nèi)，以備用。測定體液中溶菌酶含量的變化，認(rèn)為可以反映非特異性免疫功能一個方面。二．溶菌酶的殺菌作用唾液溶菌酶試驗唾液里含有溶菌酶，能溶解革蘭氏陽性菌，是機(jī)體非特異性免疫因素之一。觀察各試驗部分及對照部分生長的細(xì)菌菌落數(shù)目。2號試管只于作用60分鐘取出，采一接種環(huán)菌劃線接種于培養(yǎng)基的對照部分。 待血清與菌液作用10分鐘后，取出1號試管加以加以振蕩，使細(xì)菌均勻懸于液體中，然后采一接種菌液劃線接種于培養(yǎng)基10＇部分，再將試管放回水浴箱中繼續(xù)培養(yǎng)。然后振蕩兩支試管使之均勻混合，置37℃水浴箱中。4．再用吸管吸取傷寒桿菌培養(yǎng)液。2．，加入第1管內(nèi)。血液中的白血球及巨噬細(xì)胞對外來異物有吞噬及消化的作用，這種作用也是天然防御中的重要機(jī)制之一。正好血清中也含有許多殺菌的因素，如補(bǔ)體。如皮膚與黏膜是抵抗外來侵害的第一道屏障。這種天然獲得的免疫性首先表現(xiàn)在種的免疫上，如不同種動物對某些感染具有先天的抵抗力。選做實驗實驗一 機(jī)體的天然免疫機(jī)制目的要求：觀察機(jī)體的非特異免疫現(xiàn)象；加深理解機(jī)體的天然免疫機(jī)制。置冰箱靜置兩星期以上（使菌體殘渣自由下沉）。置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?. 用超聲波發(fā)生器中頻（約相當(dāng)于12000cps）處理20分鐘。即成粗制脂多糖，于冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。將兩次提的水溶液混合，置透析袋中于生理鹽水中透析2天，其間換幾次鹽水，以除去酚。方法：1. 細(xì)菌濃懸液用鹽水經(jīng)2500轉(zhuǎn)/分，20分鐘離心洗滌一次。近年來發(fā)現(xiàn)在酸層中也含糖類。四．菌脂多糖的制備脂多糖是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的組成成分，所以抗脂多糖抗體的制備可用革蘭氏陰性細(xì)菌菌體抗原來制備，因此這里只介紹幾種細(xì)菌脂多糖提取的方法。2．人血清——弗氏完全的制備將滅菌佐劑一份置研缽中，邊研磨邊滴加等量的含卡介苗3—4毫克/毫升的抗原液，使成油色水乳劑，研磨要充分，使乳劑滴入冰水中不擴(kuò)散。4．其它：無菌生理鹽水，無菌研缽等。3. 免疫方法（1） 選擇2—3千克健康雄兔，按如下劑量及程序免疫：日期劑量（毫升）途徑第1天全血 皮內(nèi)第3天全血 皮內(nèi)第5天全血 皮內(nèi)第7天全血 皮內(nèi)第9天全血 皮內(nèi)第12天 20%紅細(xì)胞懸液全血 靜脈第15天 20%紅細(xì)胞懸液全血 .0靜脈（2） 末次注入后7天，耳靜脈采血1毫升，滴定血液單位達(dá)1：2000以上可頸動脈放血，分離血清，放等量甘油防腐，分裝無菌安瓶，貯于4??℃中備用。（3） 用生理鹽水將紅血球配成需要濃度，即為試驗用的血球懸液。直至上清液透明無色再吸去上清夜，留密集血球備用。加入2—3倍的生理鹽水并用毛細(xì)滴管反復(fù)吹打混勻，離心沉淀5分鐘，吸去上清液。分離血清，加入防腐劑（如萬分之一的硫化汞）放4℃保存?zhèn)溆谩Ｈ粜r不高可再增量注射菌液1—2次，再行試血。日期第1天第5天第10天第15天第20天注射劑量1ml2ml（3） 末次注射后7天耳靜脈采血1毫升，分離血清。如無或微量時，該動物可用于免疫。3．免疫方法（1） 選擇體重2—3千克的健康雄兔2—3只，由耳靜脈采血1毫升，分離血清。如細(xì)菌原液1：5稀釋后其濁度與第3管相當(dāng)，則原液每毫升含菌數(shù)為9ⅹ5=45億。管號123456789101%BaCl2(ml)0. 91%H2SO4(ml)相當(dāng)菌數(shù)（億/ml）36912151821242730（3） 將洗下的細(xì)菌原液放入與比濁管相同的試管中并予以一定稀釋。%，制備好的原液及應(yīng)用液均保存在2—10℃冰箱中備用，有效期為1年。%石灰酸生理鹽水洗下H菌菌液置100℃水浴60分鐘，破壞其H抗原即為O菌液。O菌液的制備：將合格的傷寒桿菌H菌株依上法培養(yǎng)后，%石灰酸鹽水將菌苔洗下，洗液裝入無菌試管置于37℃溫箱中18—24小時殺菌得原液。得到原