【正文】 菌液接觸管壁以免污染管壁，造成結(jié)果的錯誤。1． 取普通瓊脂平板一塊，用蠟筆在底上劃分為四等分，分別標記為10＇，30＇，60＇，對照（如圖）。于30分及60分后，再取出1號試管各采一接種環(huán)菌液分別劃線接種于培養(yǎng)基相應部分。2． 將平板放37℃溫箱中培養(yǎng)24小時。分析經(jīng)血清與生理鹽水作用后細菌死亡情況及其與時間的關(guān)系。溶菌酶對于革蘭氏陽性菌的作用在于裂解細胞壁中的乙酰胞壁酸和乙酰葡糖胺之間的連接，可導致細菌死亡。材料：1． 細菌培養(yǎng)物2． %無菌生理鹽水3． 小試管2支；平皿1個；1 ml移液管 3支方法：1．試驗前一天，將細菌移種普通斜面37℃培養(yǎng)24小時，用生理鹽水洗下菌苔稀釋至適當濃度（722型分光光度計上波長450納米 ）。3． 取2支小試管， ml， ml作為對照。觀察結(jié)果：第1管 澄清透明， 第2管仍渾濁一． 吞噬作用（一）白血球的噬菌作用材料：1．動物——小白鼠2．菌種——甲型鏈球菌菌液3．無菌注射器及針頭，玻璃毛細管，美蘭染液，玻片，無菌肉湯，滅菌小棉花包。將無菌肉湯2—3毫升注射入小白鼠腹腔內(nèi)引起大量白血球聚集于小白鼠腹腔內(nèi)。3． 注射后用毛細吸管輕輕刺入小白鼠腹腔吸取腹腔液。4． 鏡檢時尋找白血球，觀察細胞染液中有無吞噬的細菌。（二）巨噬細胞吞噬紅血球的作用（示教）材料：1．動物 小白鼠2．25%雞紅血球懸液，1%可溶性淀粉，無菌注射器及針頭。2．48～72小時之后在腹腔注入25%洗滌過的雞紅血球懸液1ml。4．同法于1小時、2小時后再作一次腹腔液涂片染色鏡檢。一個巨噬細胞可吞噬數(shù)個雞紅細胞，吞噬后經(jīng)消化的雞紅細胞輪廓不清。2. 固定小白鼠：用右手輕拖鼠尾，使其趴在金屬網(wǎng)蓋上，再突然用左手拇指和食指抓緊小白鼠頸部及兩耳，將鼠體收入手掌中，再用左手無名指和手掌夾住小白鼠尾根，以無名指和小指夾住其左腿。左手傾斜使小鼠頭部向下，然后將注射器針頭自小白鼠左側(cè)腹股溝部刺入皮下，使針頭在皮下組織內(nèi)前進約1厘米左右，再直立注射器，輕輕向下刺入腹腔內(nèi)（這樣可防止拔針后注入的材料外溢）。然后將小白鼠用染料作好標記。 圖11 小白鼠腹腔注射法示意圖實驗二 50%溶血試驗（CH50）測定補體50%溶血試驗即求得能使50%致敏羊紅細胞發(fā)生溶血的最小量血清，然后計算出每毫升血清中補體含量。在50%溶血周圍，線段近似一條直線。所以用50%溶血作為終點要比100%溶血更為敏感。材料及器材1．稀釋液（磷酸鹽緩沖生理鹽水）NaCl 17gNa2HPO4 11gKH2PO4 蒸餾水 100ml使用時取此原液50ml，加90ml蒸餾水。加入100%硫酸鎂溶液1ml，可增強補體的效能。取50%細胞懸液1ml，加于14ml蒸餾水中測值為。為配制的50%細胞懸液體積，為于一定量5%細胞懸液中應加入稀釋的ml數(shù)：為已知標準化的１100個細胞／ml懸液的540值─。充分混合。３．補體CH50單位測定⑴　按下表加樣：試管號需加試劑(ml?)123456（溶血對照）7（血球?qū)φ眨?（血清對照）1：800血清樣品———1：80血清樣品———————致敏綿羊紅細胞—稀釋液—蒸餾水———————⑵　將各管充分混合。）⑶從水浴中取出后，立即將各管以２０００轉(zhuǎn)／分離心１０分鐘，將各管上清液分別移于另一試管。再減去按待測血清每管實際用量計算出的血清色度ＯＤ值（８０／８００ⅹ該管實際量ⅹ第８管ＯＤ值）。然后計算各測定管的溶血率（ｙ值）再計算各管的ｙ／（１－ｙ）值。由于50%溶血（y=）的y/(1─y)值等于1。 最后，按下列公式計算出每毫升待測血清的總補體活性，以單位/毫升表示之。常用的方法有血凝抑制、補體結(jié)合等。已知能與流感病毒發(fā)生血凝現(xiàn)象的動物紅細胞至少有22種。而在血球與病毒混合前加入病毒的特異性抗體，則血球凝集現(xiàn)象不出現(xiàn)，此稱血球凝集有抑制現(xiàn)象，借此可以鑒定病毒或測定體內(nèi)的抗體。 一．血球凝集依下表加入各樣品（單位：ml）孔號生理鹽水病毒液病毒稀釋度％雞紅細胞搖勻后室溫或4℃經(jīng)30～60分鐘結(jié)果11/1021/2031/4041/8051/16061/32071/64081/12809結(jié)果判定：觀察結(jié)果，切勿將板振搖，應輕輕拿起，觀察孔底。陰性者，血球孔底形成一個小團，光滑圓潤，邊緣整齊者。+++基本同上，大約75%血球凝集，但邊緣不整有下垂趨向者。+約有25%血球凝集，血球于孔底形成一個小團，四周有小凝集塊。凝集效價：能使血球呈++凝集的病毒最高稀釋度為凝集效價，即含一個血凝單位。依下表加入各種品（單位：ml）孔號血清稀釋度抗血清鹽水抗原混勻后作用10分鐘?％稍加振蕩置室溫60分鐘結(jié)果11/1021/2031/4041/8051/16061/32071/64081/12809血清對照10血球?qū)φ铡罡呦♂尶兹猿释耆种颇?，該血清稀釋度即為血凝抑制效價。%雞血球2滴?？滋柌《鞠♂尪龋?）生理鹽水（2）病毒1螺旋圈（3）％雞血球11：58221：102231：202241：402251：802261：1602271：3202281：6402291：128022101：25602211棄去12對照222. 室溫靜置30—40分鐘后肉眼觀察結(jié)果，必要時可用放大鏡觀察，計算結(jié)果與試管法同以++為終點。孔號血清稀釋度材料生理鹽水血清（1：10）病毒（4U）％雞血球1血清對照11—221：10—11231：20111241：4011251：8011261：16011271：32011281：64011291：1280112101：256011211棄去112病毒對照1—2血清稀釋完畢后，加入病毒稍加振搖后，%雞血球懸液各2滴，置室溫30—40分鐘觀察結(jié)果，觀察方法與試管法相同。實驗四 白細胞移動抑制試驗致敏的T淋巴細胞與相應的抗原反應，能引起代謝活化，并釋放出多種有生物活性的物質(zhì)。正常淋巴細胞無此反應。這兩種細胞免疫反應（MMIF）（或遲發(fā)型變態(tài)的反應）的體外檢查法分別叫做單核細胞移動抑制試驗或白細胞移動抑制試驗（LMIF）。檢查白細胞移動抑制因子的存在，是借其抑制白細胞移動的生物活性為指標的，依觀察白細胞移動的方式不同，移動抑制試驗有三種不同的方法，即毛細管法，瓊脂糖打孔法及瓊脂糖微滴法，這里介紹毛細管法。與不加抗原的對照相比較，顯示出白細胞移動受抑制的現(xiàn)象。本試驗采用結(jié)核桿素或pHA。兩端粗細一致。5． 培養(yǎng)小室或蓋片6． Hanks液。方法1． 淋巴細胞提?。和珽形花環(huán)試驗2． 用無菌鑷子夾毛細管，插入細胞懸液中，使細胞懸液借毛細管現(xiàn)象進入毛細管內(nèi)，在離上端7~8mm時，將毛細管取出，裝入各毛細管中，使細胞懸液高度力求相對等。取出毛細管可見細胞被壓緊里4~6mm高的柱，表層發(fā)白主要是白細胞，下層發(fā)紅為紅、白細胞混合存在。將溢滿細胞的毛細管蘸少許凡士林，置平底凹玻中固定，每凹放2~8只毛細管，而后滴加培養(yǎng)液，將毛細管分為兩組，每組3~4支，一組為實驗組，另一組為對照組。4． 凹孔上加蓋玻片封閉，勿留有氣泡，將凹玻片置于鋪有濕布紗布的鋁盒中，置37℃溫箱中培養(yǎng)18~22hr。試驗結(jié)果用移動指數(shù)MI表示：正常值80~120% 80%以下皆為抑制，即移動抑制陽性。實驗五 淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗正常機體的T淋巴細胞在體外培養(yǎng)過程中受到特異性抗原或有絲分裂原刺激。細胞免疫缺陷時，患惡性腫瘤或某些其他疾病時。目前最常用植物血凝素（PHA）作為分裂原來檢測受試者的淋巴細胞轉(zhuǎn)化率，從而判定其細胞免疫功能，稱為PHA刺激淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗。青霉素100單位/毫升鏈霉素100微克/毫升）（3） PHA（每毫升含1000微克）（4） 無菌注射器及針頭、試管、吸管。37℃靜置1—2小時。移入另一無菌試管中。棄上清液。（2） （6ⅹ106細胞）。（4） 37℃孵育68—72小時。（5） 培養(yǎng)后。將細胞重新懸起，然后移入試管中。（7） 盡量棄去上清液，將沉淀物混勻，取一滴放在載玻片上，推成血膜（頭、體、尾分明）干燥，用瑞特氏染液染色）鏡檢。每段各一縱列（目的是減少推片中細胞分布不均的誤差）。一般認為轉(zhuǎn)化率的正常值為60—70%淋巴細胞的轉(zhuǎn)化標準細胞分類 轉(zhuǎn)化的淋巴細胞 未轉(zhuǎn)化的淋巴 淋巴母細胞 過渡型細胞 胞體直徑（μm）： 10—20 10—16 6—12胞核：位置 多數(shù)位于一側(cè)，少數(shù)位于中央 中央或稍偏 多數(shù)位于中央染色質(zhì) 細松，呈顆粒狀 較粗松 致密團聚核仁 清晰可見1—3個 有或無 無有絲分裂 有時可見 無 無胞漿：量 豐富，核之一側(cè)較寬 稍寬 較少呈一窄環(huán)適堿性 ++++ +++ —++ +++—++空泡 ?？梢? 有或無 無偽足 常可見 有或無 無實驗六 NK細胞活性測定 一．放射性核素釋放實驗原理： 用放射性核素標記靶細胞，當靶細胞受到破壞時，放射性核素被釋放出來，通過測定釋放或殘留在未被破壞細胞內(nèi)的放射性核素放射活性，即可計算和推測殺傷細胞的細胞毒活性。本實驗采用51Cr釋放法檢測人NK細胞活性。當標記51Cr細胞受到損傷或死亡后，即可釋放出胞內(nèi)51Cr。 試劑與材料（1）2%十二烷基硫酸鈉（SDS）：用無菌生理鹽水配制。（3）鉻酸鈉（Na51Cr O4）.(4 )96孔U型細胞培養(yǎng)板、解剖用具、離心管、平皿、消毒用品等。（6）效應細胞：人外周血單個核細胞（PBMC） 操作流程（1）靶細胞制備：取傳代培養(yǎng)24~48小時對數(shù)生長期的K562，用RPMI1640培養(yǎng)液洗滌2次，用10%FCSRPMI1640培養(yǎng)液調(diào)細胞濃度4106/ml。RPMI1640培養(yǎng)液洗滌3次，洗去未標記的游離51Cr。如暫時不用，可放置4度保存12小時。同時設(shè)自然釋放對照孔（+%FCSRPMI1640培養(yǎng)液）和最大釋放孔（+%SDS）。（4）測定：1000r/min離心培養(yǎng)板5分鐘，加于計數(shù)管內(nèi)，用γ計數(shù)儀測定放射活性cpm值。標記后的自然釋放率應＜15%。 （3）由于放射性核素具有毒性，標記的靶細胞不宜放置過久，與效應細胞作用時間也不宜過長，因隨時間的延長死細胞增多，自然釋放率也隨之增高。當細胞受到損傷時，由于細胞膜通透性改變，LDH可從細胞內(nèi)釋放至培養(yǎng)液中。試劑與材料 （1）PBS（）：NaCl , KH2PO4 , NaHPO4 （2）1mol/L乳酸鈉溶液：。（4）1％NP40：取1ml NP40加去離子水99ml。（6）TrisNH4Cl溶液：＋（）。（8）效應細胞：小鼠脾細胞。10％FCSRPMI1640培養(yǎng)液重懸細胞，％臺盼藍染色檢測細胞存活大于95%,調(diào)整細胞濃度至1105/ ml。如此反復沖洗，直到脾臟變白為止（約沖洗5～6次），將細胞移入離心管內(nèi)，離心洗1次，1000r/min離心5～10分鐘，重復洗1次，用10％FCSRPMI1640培養(yǎng)液重懸細胞，計數(shù)細胞，并調(diào)細胞濃度至1107 /m