【正文】 之前，必須通過一系列的預備實驗來確定各成分的使用量，故本反應的實驗方法較為復雜。（1） 溶血素效價的滴定按照下表加入各物管號溶血素（ml）溶血素稀釋倍數1：20補體?（ml）生理鹽水?（ml）2%羊血球（ml）假定結果11：300搖勻后置37?℃水浴一小時全溶解21：500全溶解31：800全溶解41：1000全溶解51：1200全溶解61：1600全溶解71：2000全溶解81：2400全溶解91：3200全溶解101：4000111：4800121：6000對照1凡最高稀釋度的溶血素可呈現完全溶血者為一個單位。（3） 抗原的滴定在用已知抗原測定未知抗體時，必須先滴定抗原效價以決定本試驗時所需抗原的最適濃度（反之用已知抗體測定未知抗原時，則需滴定抗體效價） 試 管號劑1234561：5稀釋血清－－－傷寒抗原2U－－－－痢疾抗原1：80－－－－－補體2U生理鹽水－－搖勻放置37℃水浴中30min溶血素2U－2％羊血球搖勻放置37℃水浴中15min說明試驗管特異性對照血清對照抗原對照溶血素對照羊血球對照如血清對照管呈完全或部分不溶血是為抗補體現象。 實驗五 T、B淋巴細胞分離試驗淋巴細胞主要分T淋巴細胞和B淋巴細胞兩大亞群，它們具有不同的特性和功能，為此在進行某些免疫學實驗時，首先需分離出純的T淋巴細胞和B淋巴細胞。方法：1. AET—RRBC制備（1）. AET溶液的制備稱取AET粉劑402毫克，溶于10毫升蒸餾水中，用4N 。連續(xù)洗滌3—5次，每洗一次，必須充分搖勻，以減少AET—RRBC粘附成團，并觀察有無溶血。3. AET—E花環(huán)試驗：將分離的單個核細胞（2ⅹ106/毫升）與等量1%AET—RRBC混合，置37℃水浴15分鐘，每隔5分鐘搖勻一次，分裝數管，每管2—3毫升，低速離心（1000轉/分鐘）5分鐘后，移至4℃冰箱45分鐘。是測定淋巴細胞數量和功能的一種方法。目前，已廣泛應用于臨床，作為測定人群免疫狀態(tài)的一個指標。加于3毫升淋巴細胞分層液液面之上（沿管壁輕輕加入，勿使兩液相混）。3. 500轉/分離心5分鐘，放4℃冰箱中2小時后，棄大部分上清。實驗七 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）測定傷寒桿菌“O”抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗是用酶標記的抗體（或SPA）檢測未知抗原或抗體的方法。ELISA法原理如下，見圖9圖9 ELISA－SPA法原理1. 加抗原 使之吸附于固相載體（如塑料反應板）2. 洗滌 加待測血清3. 洗滌 加酶標記SpA4. 洗滌 加酶的底物。2．加待測血清于每孔內分別加不同稀釋度（如1：5，1：10，1：20…1：80）的待測血清，PBS空白對照，陰性對照血清。加2M碳酸1滴終止反應。材料：1. 20—22克健康小鼠2. 解剖器械3. 注射器，平皿，漏斗，紗布，研缽4. 20%綿羊紅細胞懸液5. 潔凈脫脂載玻片（75ⅹ25毫米），蓋玻片（22ⅹ22毫米）。將此細胞懸液經4—8層紗布過濾，1500轉/分離心5分鐘，棄上清。（4）。用凡士林將蓋片底端（其中的任一端）封住，頂端作為注入細胞混合液。7．將作好的標本水平置濕盒中，放37℃溫箱中孵60分鐘8．溶血空斑計數肉眼觀察空斑并計數兩個小室出現的溶血空斑數。經過一定時間后，動物血清中可以產生大量的特異性抗體。因此在制備免疫血清時要根據抗原的不同選擇適宜的動物種類和免疫方法。2. 菌液的制備Ⅰ.原液制備：H菌液的制備：將合格的傷寒桿菌H菌株接種于普通瓊脂的克氏瓶或大試管內 37℃孵育18—24小時。用作無菌試驗即將菌液接種于肉湯及瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)4天，無活菌生長者才可使用。Ⅱ.應用液的制備：合格的原液用標準比濁管計算含菌落數目后，用生理鹽水稀釋至每毫升含菌10億。與標準比濁管相比較，視其濁度相當于比濁管的第幾管，然后將比濁管相當菌數乘以稀釋倍數即可得到每毫升中所含細菌的數量。與進行免疫用的細菌做凝集試驗，測定有無天然凝集素。用上述菌液作試管凝集試驗，滴定抗菌血清中抗體的效價，效價在1：2000以上可放血。（溶血素）的制備材料：1． 動物：家兔2． 紅細胞懸液3． 其它：無菌生理鹽水，保存液（阿氏液）等方法：2. 紅細胞懸液的制備（1） 采血采取的綿羊血與滅菌的保存液等量混合，置冰箱中，可保存數周，也可用抗凝方法（2） 洗滌血球先將抗凝血液離心沉淀（2000cpmⅹ5分鐘）吸去上清。洗滌4次則血球變脆不適于使用。三．抗人血清抗體的制備 材料：1．動物：家兔2．人血清3．羊毛脂、石蠟油、卡介苗。3．免疫動物可采用一次性免疫法，即將抗原與佐劑制成的乳劑分多個點兔背部皮膚，也可注入足底2—，總量約3毫升，一個月后試血。經離心后沉淀含細胞殘體。7. 透析后的水溶液層經濃縮（如用聚乙二醇在透析袋外層涂抹以除去水分）。3. 處理液經3000轉/分，離心30分鐘，吸取上清液即為脂多糖抗原。3000轉/分離心30分鐘，取上清夜即為粗脂多糖抗原，置冰箱中保存?zhèn)溆谩C體的天然免疫機構對消滅侵入的微生物具有重要的作用。乙型溶菌素及備解素系統(tǒng)等，可殺死革蘭氏陰性或陽性細菌。3．，加入第二管內。1． 取普通瓊脂平板一塊，用蠟筆在底上劃分為四等分，分別標記為10＇，30＇，60＇，對照（如圖）。2． 將平板放37℃溫箱中培養(yǎng)24小時。溶菌酶對于革蘭氏陽性菌的作用在于裂解細胞壁中的乙酰胞壁酸和乙酰葡糖胺之間的連接，可導致細菌死亡。3． 取2支小試管， ml， ml作為對照。將無菌肉湯2—3毫升注射入小白鼠腹腔內引起大量白血球聚集于小白鼠腹腔內。4． 鏡檢時尋找白血球，觀察細胞染液中有無吞噬的細菌。2．48～72小時之后在腹腔注入25%洗滌過的雞紅血球懸液1ml。一個巨噬細胞可吞噬數個雞紅細胞，吞噬后經消化的雞紅細胞輪廓不清。左手傾斜使小鼠頭部向下，然后將注射器針頭自小白鼠左側腹股溝部刺入皮下，使針頭在皮下組織內前進約1厘米左右，再直立注射器，輕輕向下刺入腹腔內（這樣可防止拔針后注入的材料外溢）。 圖11 小白鼠腹腔注射法示意圖實驗二 50%溶血試驗（CH50）測定補體50%溶血試驗即求得能使50%致敏羊紅細胞發(fā)生溶血的最小量血清，然后計算出每毫升血清中補體含量。所以用50%溶血作為終點要比100%溶血更為敏感。加入100%硫酸鎂溶液1ml，可增強補體的效能。為配制的50%細胞懸液體積，為于一定量5%細胞懸液中應加入稀釋的ml數：為已知標準化的１100個細胞／ml懸液的540值─。３．補體CH50單位測定⑴　按下表加樣：試管號需加試劑(ml?)123456（溶血對照）7（血球對照）8（血清對照）1：800血清樣品———1：80血清樣品———————致敏綿羊紅細胞—稀釋液—蒸餾水———————⑵　將各管充分混合。再減去按待測血清每管實際用量計算出的血清色度ＯＤ值（８０／８００ⅹ該管實際量ⅹ第８管ＯＤ值）。由于50%溶血（y=）的y/(1─y)值等于1。常用的方法有血凝抑制、補體結合等。而在血球與病毒混合前加入病毒的特異性抗體，則血球凝集現象不出現，此稱血球凝集有抑制現象，借此可以鑒定病毒或測定體內的抗體。陰性者，血球孔底形成一個小團，光滑圓潤，邊緣整齊者。+約有25%血球凝集，血球于孔底形成一個小團，四周有小凝集塊。依下表加入各種品（單位：ml）孔號血清稀釋度抗血清鹽水抗原混勻后作用10分鐘?％稍加振蕩置室溫60分鐘結果11/1021/2031/4041/8051/16061/32071/64081/12809血清對照10血球對照——最高稀釋孔仍呈完全抑制凝集，該血清稀釋度即為血凝抑制效價?？滋柌《鞠♂尪龋?）生理鹽水（2）病毒1螺旋圈（3）％雞血球11：58221：102231：202241：402251：802261：1602271：3202281：6402291：128022101：25602211棄去12對照222. 室溫靜置30—40分鐘后肉眼觀察結果，必要時可用放大鏡觀察，計算結果與試管法同以++為終點。實驗四 白細胞移動抑制試驗致敏的T淋巴細胞與相應的抗原反應，能引起代謝活化，并釋放出多種有生物活性的物質。這兩種細胞免疫反應（MMIF）（或遲發(fā)型變態(tài)的反應）的體外檢查法分別叫做單核細胞移動抑制試驗或白細胞移動抑制試驗（LMIF）。與不加抗原的對照相比較，顯示出白細胞移動受抑制的現象。兩端粗細一致。方法1． 淋巴細胞提?。和珽形花環(huán)試驗2． 用無菌鑷子夾毛細管，插入細胞懸液中，使細胞懸液借毛細管現象進入毛細管內，在離上端7~8mm時，將毛細管取出，裝入各毛細管中，使細胞懸液高度力求相對等。將溢滿細胞的毛細管蘸少許凡士林，置平底凹玻中固定，每凹放2~8只毛細管，而后滴加培養(yǎng)液，將毛細管分為兩組，每組3~4支，一組為實驗組，另一組為對照組。試驗結果用移動指數MI表示：正常值80~120% 80%以下皆為抑制，即移動抑制陽性。細胞免疫缺陷時，患惡性腫瘤或某些其他疾病時。青霉素100單位/毫升鏈霉素100微克/毫升）（3） PHA（每毫升含1000微克）（4） 無菌注射器及針頭、試管、吸管。移入另一無菌試管中。（2） （6ⅹ106細胞）。（5） 培養(yǎng)后。（7） 盡量棄去上清液，將沉淀物混勻，取一滴放在載玻片上，推成血膜（頭、體、尾分明）干燥，用瑞特氏染液染色）鏡檢。一般認為轉化率的正常值為60—70%淋巴細胞的轉化標準細胞分類 轉化的淋巴細胞 未轉化的淋巴 淋巴母細胞 過渡型細胞 胞體直徑（μm）： 10—20 10—16 6—12胞核：位置 多數位于一側，少數位于中央 中央或稍偏 多數位于中央染色質 細松，呈顆粒狀 較粗松 致密團聚核仁 清晰可見1—3個 有或無 無有絲分裂 有時可見 無 無胞漿：量 豐富，核之一側較寬 稍寬 較少呈一窄環(huán)適堿性 ++++ +++ —++ +++—++空泡 ?？梢? 有或無 無偽足 ?？梢? 有或無 無實驗六 NK細胞活性測定 一．放射性核素釋放實驗原理： 用放射性核素標記靶細胞，當靶細胞受到破壞時，放射性核素被釋放出來，通過測定釋放或殘留在未被破壞細胞內的放射性核素放射活性，即可計算和推測殺傷細胞的細胞毒活性。當標記51Cr細胞受到損傷或死亡后，即可釋放出胞內51Cr。（3）鉻酸鈉（Na51Cr O4）.(4 )96孔U型細胞培養(yǎng)板、解剖用具、離心管、平皿、消毒用品等。RPMI1640培養(yǎng)液洗滌3次，洗去未標記的游離51Cr。同時設自然釋放對照孔（+%FCSRPMI1640培養(yǎng)液）和最大釋放孔（+%SDS）。標記后的自然釋放率應＜15%。當細胞受到損傷時，由于細胞膜通透性改變，LDH可從細胞內釋放至培養(yǎng)液中。 （2）1mol/L乳酸鈉溶液：。（6）TrisNH4Cl溶液：＋（）。10％FCSRPMI1640培養(yǎng)液重懸細胞，％臺盼藍染色檢測細胞存活大于95%,調整細胞濃度至1105/ m