【正文】 理狀態(tài)： 真菌、酵母 106個 /ml， 放線菌孢子 106~107個 /ml,細菌 108個 /ml， ? 細菌選擇 對數(shù)生長期 ，真菌和放線菌使用 幼年孢子 ，芽孢細菌也可以用芽孢進行誘變處理。 ? 力求 90%以上為單孢子，制菌懸液用生理鹽水或緩沖溶液 。 出發(fā)菌株的選擇 2022年 9月 20日星期二 長江大學生科院生物工程系 58 誘變劑的選擇 ● 考慮誘變劑的作用機理 ， 根據(jù)實際操作方便或成功的經驗； ● 實踐證明并非所有誘變劑對某個出發(fā)菌株都是有效的； ● 誘變劑的誘變作用 ， 還取決于出發(fā)菌株的特性及其誘變史 。 誘變劑作用細胞后 ， 對 DNA作用引起突變 ， 但不一定都能形成突變體 ， 原因是 菌體為了生存 ， 具有一套自我修復系統(tǒng) 。 2022年 9月 20日星期二 長江大學生科院生物工程系 59 誘變劑量的選擇 劑量的大小常以 致死率 和 誘變率 來確定 。 最適劑量是指能夠提高正突變株變異頻率幅度的誘變劑量 。 處理劑量大 ， 致死率高 ， 誘變率也會提高 ， 但達到一定程度后 ， 再提高劑量反而會下降；但誘變劑量也不宜過低 ， 否則很難獲得所需的正突變株 。 致死率 90%~ %（ 過去 ） 70%~80%（ 現(xiàn)在 ） 。 2022年 9月 20日星期二 長江大學生科院生物工程系 60 （ 二 ） 誘變劑處理的方式 （ 1） 直接處理 ：將菌懸液用誘變劑直接處理 ， 然后分離 。 （ 2） 生長過程處理 ：適用于誘變作用強而致死率低的誘變劑 ， 或只在分裂過程中對 DNA起作用的誘變劑 ， 如秋水仙素 。這些誘變劑一般都直接加入到培養(yǎng)基中 ， 混勻 ， 倒入平皿制成平板后培養(yǎng) ， 在生長過程中誘發(fā)菌體突變 。 （ 3） 振蕩培養(yǎng)處理 ：即在搖瓶培養(yǎng)基中加入一定量的誘變劑 。 菌體隨著振蕩培養(yǎng) ， 不斷地和誘變劑接觸 ， 它們之間的作用遠比平板生長過程處理充分得多 ， 所以誘變劑濃度不宜過高 。 2022年 9月 20日星期二 長江大學生科院生物工程系 61 （ 三 ） 誘變篩選流程 (致死率 、 突變率 、 正變率 、 高產率 、 投產率 ) 出發(fā)菌種 斜面 或 搖瓶 培養(yǎng) 24h 細菌懸液 稀釋涂 平板 單孢子懸液 誘變處理 挑取單菌落 200個 搖瓶 初篩 50株 挑出高產斜面 留種保 藏菌種 傳種斜面 搖瓶 復篩 5株 挑出高產菌株 放大 罐 試驗 ， 中試考查 大型投產試驗 2022年 9月 20日星期二 長江大學生科院生物工程系 62 誘變篩選 過 程 中的 致死率 、 突變率 、 正變率 、 高產率 、 投產率 2022年 9月 20日星期二 長江大學生科院生物工程系 63 （ 四 ） 篩選的方法 ? 隨機篩選 也稱搖瓶篩選 ， 具體做法是：將誘變處理后菌體分離到瓊脂平板上 ， 培養(yǎng)后 隨機挑選菌落 ， 一個菌落移入一支斜面 ，然后一支斜面的菌體接入一個三角瓶 ， 放置在搖床上振蕩培養(yǎng) ， 根據(jù)所測定產物活性的高低 ， 決定取舍 。 該法缺點是盲目性大 ， 在突變概率小的情況下 ， 如果菌落挑取少了 ， 很難篩選到理想的突變株 。 ? 先平板菌落預篩 ， 再搖瓶振蕩培養(yǎng)復篩 大量菌落先經過平板預篩 ， 保留 5%~10%的預篩菌株 （ 約200株 ） ， 再進行搖瓶培養(yǎng) ， 復證被篩菌株的重演性 ， 同時從200株中篩選出更高產量的突變株 。 2022年 9月 20日星期二 長江大學生科院生物工程系 64 此法不僅減少了人力物力 ， 縮短了周期 ， 而且減少了盲目性 ，提高了篩選效率 。 通過平板菌落預篩主要是淘汰那些低產菌株 ， 有的是根據(jù) 菌落形態(tài) 來淘汰 ， 如紅霉素產生菌 ， 若突變株是帶色素的 ， 往往是低產株應淘汰；有的是根據(jù) 生化反應特征 來淘汰 ， 如抑菌圈 、變色圈 、 透明圈或其他特異性反應圈 。 篩選的關鍵 是選擇一定的特征（如菌落特征、生化特征等）去判斷所篩選的菌株是我們所需要的突變株。 2022年 9月 20日星期二 長江大學生科院生物工程系 65 （五）幾種誘變劑的使用方法 新鮮斜面菌種 +生理鹽水或緩沖液洗下 → 振蕩 →稀釋菌懸液 → 取 5ml菌懸液 → 無菌培養(yǎng)皿 → 磁力攪拌→ 15W、 30cm紫外燈（營養(yǎng)體 3~5min，芽孢 10min）照射 → 黑紙包好增殖培養(yǎng) → 挑單菌落 化學誘變（以亞硝酸為例） 亞硝酸易分解，故常在誘變前用亞硝酸鈉在 的醋酸緩沖液中生成亞硝酸的方法現(xiàn)配現(xiàn)用。 紫外線誘變 2022年 9月 20日星期二 長江大學生科院生物工程系 66 取孢子懸液 2ml，加入 1ml ， 27℃ 保溫處理若干分鐘（如 10min）后，取出 2ml加到 10ml ， pH下降至 。然后稀釋涂平板，培養(yǎng)后挑單菌落進行選擇。 處理真菌孢子： 2022年 9月 20日星期二 長江大學生科院生物工程系 67 處理細菌 ? 將 出發(fā)菌株 接入 5ml肉湯中，于 370C振蕩培養(yǎng)至 對數(shù)生長期 ，離心收集菌體，加入數(shù)亳升無菌生理鹽水，洗滌一次，離心后菌體懸浮在 （ ），然后加入 ，在 370C處理數(shù)分鐘（如 5min）后稀釋涂皿，培養(yǎng)后挑取單菌落，選擇突變株。 2022年 9月 20日星期二 長江大學生科院生物工程系 68 航天育種 所謂航天育種是利用空間環(huán)境 高真空 、 微重力 和 強輻射 的特點，在宇宙射線的輻射作用下，使生物的遺傳性狀發(fā)生變異，從而選育出優(yōu)良品種。 1996年以來，國防科工委相繼組織了返地衛(wèi)星和高空氣球搭載微生物、動物細胞和植物種子，為微生物的誘變育種提供了新的手段。 2022年 9月 20日星期二 長江大學生科院生物工程系 69 ? 神舟七號飛船搭載微生物菌種包括 靈芝 、 平菇 、 蟲草 、 雙孢蘑菇 、 杏鮑菇 、 茶樹菇 6種19管 ? 中國南方航天育種技術研究中心和江西省農科院微生物研究所共同合作，采用航天育種誘變技術培育出的金針菇 “ 航金１號 ” 和“ 航金２號 ” ，日前通過專家鑒定。具有抗雜性強、早熟、耐高溫、品質好、產量高等特點 航天育種 2022年 9月 20日星期二 長江大學生科院生物工程系 70 思考題 ? 自然界分離微生物的一般操作步驟？ 從環(huán)境中分離目的微生物時，為何一定要進行富集富集？ 什么叫自然選育？自然選育在工藝生產中的意義？ 誘變育種對出發(fā)菌株有哪些要求？ 誘變選育的流程？ 工業(yè)上優(yōu)良生產菌種應具備哪些基本特性？