【正文】 理狀態(tài)： 真菌、酵母 106個(gè) /ml， 放線菌孢子 106~107個(gè) /ml,細(xì)菌 108個(gè) /ml， ? 細(xì)菌選擇 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 ，真菌和放線菌使用 幼年孢子 ，芽孢細(xì)菌也可以用芽孢進(jìn)行誘變處理。 ? 力求 90%以上為單孢子，制菌懸液用生理鹽水或緩沖溶液 。 出發(fā)菌株的選擇 2022年 9月 20日星期二 長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系 58 誘變劑的選擇 ● 考慮誘變劑的作用機(jī)理 ， 根據(jù)實(shí)際操作方便或成功的經(jīng)驗(yàn)； ● 實(shí)踐證明并非所有誘變劑對(duì)某個(gè)出發(fā)菌株都是有效的； ● 誘變劑的誘變作用 ， 還取決于出發(fā)菌株的特性及其誘變史 。 誘變劑作用細(xì)胞后 ， 對(duì) DNA作用引起突變 ， 但不一定都能形成突變體 ， 原因是 菌體為了生存 ， 具有一套自我修復(fù)系統(tǒng) 。 2022年 9月 20日星期二 長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系 59 誘變劑量的選擇 劑量的大小常以 致死率 和 誘變率 來(lái)確定 。 最適劑量是指能夠提高正突變株變異頻率幅度的誘變劑量 。 處理劑量大 ， 致死率高 ， 誘變率也會(huì)提高 ， 但達(dá)到一定程度后 ， 再提高劑量反而會(huì)下降；但誘變劑量也不宜過(guò)低 ， 否則很難獲得所需的正突變株 。 致死率 90%~ %（ 過(guò)去 ） 70%~80%（ 現(xiàn)在 ） 。 2022年 9月 20日星期二 長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系 60 （ 二 ） 誘變劑處理的方式 （ 1） 直接處理 ：將菌懸液用誘變劑直接處理 ， 然后分離 。 （ 2） 生長(zhǎng)過(guò)程處理 ：適用于誘變作用強(qiáng)而致死率低的誘變劑 ， 或只在分裂過(guò)程中對(duì) DNA起作用的誘變劑 ， 如秋水仙素 。這些誘變劑一般都直接加入到培養(yǎng)基中 ， 混勻 ， 倒入平皿制成平板后培養(yǎng) ， 在生長(zhǎng)過(guò)程中誘發(fā)菌體突變 。 （ 3） 振蕩培養(yǎng)處理 ：即在搖瓶培養(yǎng)基中加入一定量的誘變劑 。 菌體隨著振蕩培養(yǎng) ， 不斷地和誘變劑接觸 ， 它們之間的作用遠(yuǎn)比平板生長(zhǎng)過(guò)程處理充分得多 ， 所以誘變劑濃度不宜過(guò)高 。 2022年 9月 20日星期二 長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系 61 （ 三 ） 誘變篩選流程 (致死率 、 突變率 、 正變率 、 高產(chǎn)率 、 投產(chǎn)率 ) 出發(fā)菌種 斜面 或 搖瓶 培養(yǎng) 24h 細(xì)菌懸液 稀釋涂 平板 單孢子懸液 誘變處理 挑取單菌落 200個(gè) 搖瓶 初篩 50株 挑出高產(chǎn)斜面 留種保 藏菌種 傳種斜面 搖瓶 復(fù)篩 5株 挑出高產(chǎn)菌株 放大 罐 試驗(yàn) ， 中試考查 大型投產(chǎn)試驗(yàn) 2022年 9月 20日星期二 長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系 62 誘變篩選 過(guò) 程 中的 致死率 、 突變率 、 正變率 、 高產(chǎn)率 、 投產(chǎn)率 2022年 9月 20日星期二 長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系 63 （ 四 ） 篩選的方法 ? 隨機(jī)篩選 也稱搖瓶篩選 ， 具體做法是：將誘變處理后菌體分離到瓊脂平板上 ， 培養(yǎng)后 隨機(jī)挑選菌落 ， 一個(gè)菌落移入一支斜面 ，然后一支斜面的菌體接入一個(gè)三角瓶 ， 放置在搖床上振蕩培養(yǎng) ， 根據(jù)所測(cè)定產(chǎn)物活性的高低 ， 決定取舍 。 該法缺點(diǎn)是盲目性大 ， 在突變概率小的情況下 ， 如果菌落挑取少了 ， 很難篩選到理想的突變株 。 ? 先平板菌落預(yù)篩 ， 再搖瓶振蕩培養(yǎng)復(fù)篩 大量菌落先經(jīng)過(guò)平板預(yù)篩 ， 保留 5%~10%的預(yù)篩菌株 （ 約200株 ） ， 再進(jìn)行搖瓶培養(yǎng) ， 復(fù)證被篩菌株的重演性 ， 同時(shí)從200株中篩選出更高產(chǎn)量的突變株 。 2022年 9月 20日星期二 長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系 64 此法不僅減少了人力物力 ， 縮短了周期 ， 而且減少了盲目性 ，提高了篩選效率 。 通過(guò)平板菌落預(yù)篩主要是淘汰那些低產(chǎn)菌株 ， 有的是根據(jù) 菌落形態(tài) 來(lái)淘汰 ， 如紅霉素產(chǎn)生菌 ， 若突變株是帶色素的 ， 往往是低產(chǎn)株應(yīng)淘汰；有的是根據(jù) 生化反應(yīng)特征 來(lái)淘汰 ， 如抑菌圈 、變色圈 、 透明圈或其他特異性反應(yīng)圈 。 篩選的關(guān)鍵 是選擇一定的特征（如菌落特征、生化特征等）去判斷所篩選的菌株是我們所需要的突變株。 2022年 9月 20日星期二 長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系 65 （五）幾種誘變劑的使用方法 新鮮斜面菌種 +生理鹽水或緩沖液洗下 → 振蕩 →稀釋菌懸液 → 取 5ml菌懸液 → 無(wú)菌培養(yǎng)皿 → 磁力攪拌→ 15W、 30cm紫外燈（營(yíng)養(yǎng)體 3~5min，芽孢 10min）照射 → 黑紙包好增殖培養(yǎng) → 挑單菌落 化學(xué)誘變（以亞硝酸為例） 亞硝酸易分解，故常在誘變前用亞硝酸鈉在 的醋酸緩沖液中生成亞硝酸的方法現(xiàn)配現(xiàn)用。 紫外線誘變 2022年 9月 20日星期二 長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系 66 取孢子懸液 2ml，加入 1ml ， 27℃ 保溫處理若干分鐘（如 10min）后，取出 2ml加到 10ml ， pH下降至 。然后稀釋涂平板，培養(yǎng)后挑單菌落進(jìn)行選擇。 處理真菌孢子： 2022年 9月 20日星期二 長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系 67 處理細(xì)菌 ? 將 出發(fā)菌株 接入 5ml肉湯中，于 370C振蕩培養(yǎng)至 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 ，離心收集菌體，加入數(shù)亳升無(wú)菌生理鹽水，洗滌一次，離心后菌體懸浮在 （ ），然后加入 ，在 370C處理數(shù)分鐘（如 5min）后稀釋涂皿，培養(yǎng)后挑取單菌落，選擇突變株。 2022年 9月 20日星期二 長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系 68 航天育種 所謂航天育種是利用空間環(huán)境 高真空 、 微重力 和 強(qiáng)輻射 的特點(diǎn)，在宇宙射線的輻射作用下，使生物的遺傳性狀發(fā)生變異，從而選育出優(yōu)良品種。 1996年以來(lái)，國(guó)防科工委相繼組織了返地衛(wèi)星和高空氣球搭載微生物、動(dòng)物細(xì)胞和植物種子，為微生物的誘變育種提供了新的手段。 2022年 9月 20日星期二 長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系 69 ? 神舟七號(hào)飛船搭載微生物菌種包括 靈芝 、 平菇 、 蟲草 、 雙孢蘑菇 、 杏鮑菇 、 茶樹菇 6種19管 ? 中國(guó)南方航天育種技術(shù)研究中心和江西省農(nóng)科院微生物研究所共同合作，采用航天育種誘變技術(shù)培育出的金針菇 “ 航金１號(hào) ” 和“ 航金２號(hào) ” ，日前通過(guò)專家鑒定。具有抗雜性強(qiáng)、早熟、耐高溫、品質(zhì)好、產(chǎn)量高等特點(diǎn) 航天育種 2022年 9月 20日星期二 長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系 70 思考題 ? 自然界分離微生物的一般操作步驟？ 從環(huán)境中分離目的微生物時(shí)，為何一定要進(jìn)行富集富集？ 什么叫自然選育？自然選育在工藝生產(chǎn)中的意義？ 誘變育種對(duì)出發(fā)菌株有哪些要求？ 誘變選育的流程？ 工業(yè)上優(yōu)良生產(chǎn)菌種應(yīng)具備哪些基本特性？