【正文】 性的一個重要因素?！「渭毎豍450功能下降學(xué)說有人考察了大鼠P450的表達和硝酸酯耐受性之間的關(guān)系[17]，經(jīng)丙酮（P450誘導(dǎo)劑）預(yù)處理的鼠在連續(xù)注射48小時NTG之后，血管中NO生成量增加，且亞硝酸鹽和硝酸鹽也大大高于正常水平。實驗認為細胞色素P450酶系中的CYP1A2可催化硝酸甘油和硝酸異山梨醇酯轉(zhuǎn)化為NO這一過程。他們還做了另外一個實驗來說明細胞色素P450在硝酸酯耐受情況下的作用[18]。將大鼠靜脈注射NTG或硝酸異山梨醇酯24－96小時建立耐受模型，連續(xù)48或72小時注射NTG或硝酸異山梨醇酯，觀察到硝酸酯耐受之后，肝臟P450水平明顯下降，停藥48小時后可恢復(fù)正常。當(dāng)給予在動物實驗中不表現(xiàn)耐受性的硝普鈉時，沒有發(fā)現(xiàn)P450下降的現(xiàn)象。緩慢給予硝酸酯時可見肝臟P450水平顯著降低。這兩個實驗說明，連續(xù)使用硝酸酯類藥物可致細胞色素P450的水平下降，而后者又致硝酸酯轉(zhuǎn)化為NO這一過程受阻，因此，二者相互影響，且細胞色素P450的表達和活性是硝酸酯耐受的一個關(guān)鍵因素。4． 展望由上述討論可見，有關(guān)硝酸酯的體內(nèi)作用及其快速耐受性現(xiàn)象的發(fā)生機制至今仍是眾說紛紜，但耐受性可能是多種因素共同作用的結(jié)果，可針對不同的耐受機制采取不同的措施。這對于需長期應(yīng)用硝酸酯類藥物的冠心病和心力衰竭病人來說具有非常重要的意義，同時具備臨床實用價值，值得進一步研究和討論。參考文獻略。腦缺血與細胞凋亡徐艷紅，王志浩（山東大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)七年制99級）張岫美1． 概述缺血性腦損傷是一種常見病多發(fā)病，嚴(yán)重危害人類特別是中老年人的健康。其發(fā)病的病理生理機制復(fù)雜，盡管各個研究機構(gòu)對腦缺血的研究很多，但迄今尚未完全闡明。目前認為其病理生理機制包括氧化性損傷、興奮性毒性、鈣超載、炎癥性損傷、細胞凋亡等等。細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，是指細胞接受某種信號后或收到某種因素刺激后一種主動的，與一些相關(guān)基因相互作用，以細胞內(nèi) DNA早期降解為特征的自殺過程。自1972年Kerr提出凋亡的概念之后，細胞凋亡成為許多領(lǐng)域的研究熱點。1993年，MacManus首次報告了腦缺血中凋亡現(xiàn)象的存在[1]。自此對缺血性腦損傷病理生理機制的研究出現(xiàn)了一個新的方面，并為缺血性腦損傷的治療提出了一條新的思路。2．腦缺血后神經(jīng)元凋亡的證據(jù)特征性的凋亡細胞形態(tài)和DNA片斷是細胞凋亡的兩個重要標(biāo)志，形態(tài)學(xué)上的特征性變化包括細胞膜空泡化、胞漿濃縮、染色質(zhì)邊集，凋亡小體形成等；凋亡細胞的另一突出特征是細胞染色質(zhì)DNA的降解，即核內(nèi)DNA在內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的作用下，于核小體連接部發(fā)生斷裂，將染色質(zhì)切成185~200bp的DNA片斷，這些片斷在瓊脂糖凝膠電泳中可呈特征性的“梯狀”條帶。1993年，MacManus首先在全腦缺血大鼠模型中發(fā)現(xiàn)呈梯狀的DNA電泳[1]，接著又報道了在局灶性暫時性腦缺血中也有同樣發(fā)現(xiàn)[2]。Yao等應(yīng)用常規(guī)凝膠電泳以及pulsefield凝膠電泳法對大鼠局灶性腦缺血后缺血半暗區(qū)和缺血中心區(qū)DNA片斷進行研究[3]，常規(guī)電泳在大腦中動脈阻塞（MCAO）后3小時在缺血半暗區(qū)和缺血中心區(qū)均發(fā)現(xiàn)50kbp和20kbp的大片斷，pulsefield凝膠電泳發(fā)現(xiàn)半暗區(qū)的大片斷在缺血后6小時進一步降解為小片斷。說明DNA降解是一個逐步發(fā)展的過程。除DNA電泳外，凋亡細胞的檢測方法還有直接形態(tài)觀察、TUNEL法、流式細胞術(shù)等。張秋玲等[4] 利用沙土鼠進行研究，結(jié)扎沙土鼠雙側(cè)頸總動脈5分鐘，造成前腦缺血，灌流不同時間后取海馬組織，分別利用上述幾種方法進行研究，證實腦缺血后神經(jīng)元凋亡的存在。3．神經(jīng)元的凋亡途徑3．1 caspase途徑caspase (cysteinecontaining aspartatespecific protease)凋亡蛋白酶是一組對底物天冬氨酸部位有特異水解作用、其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶，目前發(fā)現(xiàn)該家族有14個成員，caspase 在凋亡中所起的作用主要是：滅活凋亡抑制物（如Bcl2）；水解細胞的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細胞解體，形成凋亡小體；在凋亡級聯(lián)反應(yīng)中水解相關(guān)活性蛋白，從而使該蛋白獲得或喪失某種生物學(xué)功能。caspase的活化有兩種途徑： 一種是細胞外通路，即死亡受體途徑。死亡受體屬于腫瘤壞死因子（TNF）受體超家族，包括Fas、TNFRDR DR5，它們在胞質(zhì)側(cè)均有一個死亡結(jié)構(gòu)域（DD），相應(yīng)死亡配體為FasL、TNF、TNF誘導(dǎo)相關(guān)凋亡配體（TNFrelatedinducing Ligand，TRAIL），腦缺血發(fā)生后，死亡受體及配體表達增加，受體配體結(jié)合，激活與DD結(jié)合的caspase8,進一步激活caspase3，引發(fā)凋亡的一系列反應(yīng)。Jin等研究發(fā)現(xiàn)[5]，缺血后Fas和FasL表達增加，F(xiàn)ADD表達也增加，進而caspase10而不是caspase8被活化，然后是 caspase3活化。說明caspase10可能也參與該途徑，并與caspase8的作用相同。Wang等[6]的一項研究發(fā)現(xiàn)抑制TNFa轉(zhuǎn)化酶TACE (tumor necrosis factoralphaconverting enzyme)活性后，雖能明顯減少TNFa的生成及梗死體積，但對于caspase3的表達及DNA 片斷化并無影響。需要進一步研究，可能是其他的腫瘤壞死因子而不是TNFa參與凋亡過程，而抑制TNFa可以減小梗死體積正好說明腦缺血病生機制的復(fù)雜性，不是一種機制參與缺血性腦損傷。 另一種是細胞內(nèi)通路，主要由細胞色素C(cytoC)介導(dǎo)。細胞內(nèi)外各種死亡信號可誘導(dǎo)線粒體釋放cytoC, cytoC再與Apaf1結(jié)合,使其發(fā)生構(gòu)象改變,既而寡聚化,然后與procaspase9結(jié)合,三者形成“凋亡體”，使procaspase9活化，進而激活caspase3。腦缺血后線粒體cytoC的釋放是該通路的關(guān)鍵，Bcl2家族也是作用于該通路對凋亡進行調(diào)節(jié)的。Ferrer等[7] 對大腦中動脈阻塞（MCAO）再灌模型研究發(fā)現(xiàn)，缺血后半暗帶Bcl2和Bax表達均增加，且Bax由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體，CytoC由線粒體釋放到細胞質(zhì)，同時伴有caspase3的活化。上述兩種途徑研究較多，對凋亡的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑近幾年來也有所研究[8]，caspase家族中的caspase12被認為參與該過程。 3．2非caspase途徑AIF易位 凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）也是一種線粒體蛋白，但與CytoC不同的是它引起得細胞凋亡與caspase無關(guān)，在腦缺血引起的細胞凋亡中同樣有AIF的參與。Plesnila等研究發(fā)現(xiàn)[9]，將體外培養(yǎng)的48小時的大鼠神經(jīng)元氧及葡萄糖移除（OGD）后，檢測到AIF由線粒體轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)AIF易位與CytoC的釋放同時發(fā)生甚至更早，并且早于細胞凋亡的發(fā)生。Cao等的研究也發(fā)現(xiàn)[10]，在暫時性腦缺血模型中AIF從線粒體易位到細胞核內(nèi)，且AIF易位時間與DNA大片斷形成時間一致，早于核小體DNA片斷的形成。該研究亦證明，AIF易位不能由通過抑制caspase的活性所阻滯，但能被抗凋亡蛋白 BclxL抑制。calpain途徑 calpain屬于papain（也是一種半胱氨酸蛋白酶）家族，被Ca2+激活后，作用于細胞骨架蛋白等底物，引起細胞死亡，以往一直認為calpain主要參與細胞壞死，但越來越多的證據(jù)表明它也在凋亡中起重要作用。王宇卉等利用大腦中動脈缺血再灌注模型研究發(fā)現(xiàn)[11] ，缺血腦組織中calpain mRNA表達及蛋白質(zhì)活化均顯著增加,成雙峰式，其時相分布與細胞內(nèi)鈣超載相一致，由于鈣離子內(nèi)流和細胞骨架分解都在細胞凋亡中起作用，因此越來越多的學(xué)者認為calpain也在細胞凋亡中起作用。該研究還發(fā)現(xiàn)calpain活化雙峰第二個更明顯，此時還伴有caspase3的活化以及DNA雙鏈損傷，進一步支持calpain在遲發(fā)性細胞死亡中起重要作用，該過程主要為細胞凋亡。有研究表明[12]在腦缺血中calpain的激活發(fā)生于凋亡形態(tài)變化和DNA片段化之前,在DNA梯帶出現(xiàn)前易位到細胞核，應(yīng)用calpain抑制劑具有抑制蛋白溶解的作用，還能減少凋亡的形態(tài)變化,且與caspase抑制劑具有協(xié)同作用。4．腦缺血后凋亡調(diào)節(jié)因素的變化 Bcl2家族 Bcl2家族是細胞凋亡中一類重要的調(diào)節(jié)基因，該家族表達的蛋白按其作用可分為兩類，促進凋亡的有Bax、Bak、Bik、Bad等，抑制凋亡的有BclBclXL、Bclw等，其中Bcl2和Bax是研究較多的兩種。丁愛石等利用體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元研究發(fā)現(xiàn)[13]，缺氧2小時海馬神經(jīng)元對Bcl2和Bax的表達均較缺氧前增強，缺氧4小時及缺氧4小時復(fù)氧2472小時，海馬神經(jīng)元對Bcl2的表達逐漸減弱，而對Bax的表達逐漸增強，且TUNEL 染色顯示缺氧24小時凋亡神經(jīng)元百分率與缺氧前無明顯差別，但缺氧4小時復(fù)氧2472小時凋亡神經(jīng)元明顯增加。章軍建等[14]利用大鼠中動脈阻塞再通模型研究發(fā)現(xiàn)，大鼠中動脈閉塞2小時再通48小時后，TUNEL陽性細胞主要分布于梗死灶周圍的內(nèi)側(cè)尾殼核和額頂部皮層，同時該區(qū)域Bcl2和Bax陽性細胞數(shù)明顯增加，且Bcl2/Bax陽性細胞數(shù)的比例較其它腦區(qū)及對照組明顯降低。郭云良等[15]研究認為細胞是否發(fā)生凋亡取決于二者的比例。腦缺血后Bcl2 mRNA表達成全腦性增高，并隨缺血時間的延長而下降，提示較輕微的腦缺血損傷誘發(fā)Bcl2高表達可能是神經(jīng)元存活的重要原因；梗塞時間延長，缺血灶內(nèi)Bcl2 mRNA 表達明顯降低，梗死灶周圍的缺血半暗區(qū)仍存在較高水平的Bcl2 mRNA,提示Bcl2在維持缺血半暗區(qū)神經(jīng)元存活方面起重要作用[16]。 Cao等人研究暫時性腦缺血后Bax 的變化[17]，缺血30分再灌注172小時，發(fā)現(xiàn)尾狀核神經(jīng)元Bax從胞質(zhì)迅速易位到線粒體，與線粒體上的膜相關(guān)蛋白ANT形成異源二聚體，并且與線粒體cytoC和capase9 的釋放在時空上一致。 ICE 即白介素1b轉(zhuǎn)換酶，是目前認識的細胞凋亡重要調(diào)控基因之一 ,caspase即是ICE樣蛋白酶。其作用位于細胞凋亡通路中的重要環(huán)節(jié),激活后直接引起蛋白切割,導(dǎo)致細胞凋亡。趙士福等[18]應(yīng)用免疫組化及分子雜交技術(shù)對大鼠全腦缺血模型進行研究，發(fā)現(xiàn)缺血再灌注12小時后ICE基因表達增加,4872小時達到峰,7天表達下降。凋亡細胞在缺血再灌注12小時出現(xiàn),達峰時間也在4872小時 ,且ICE的表達在分布上與神經(jīng)細胞凋亡的發(fā)生有顯著相關(guān)性。 p53 野生型p53基因具有誘導(dǎo)細胞凋亡的作用，它編碼的P53蛋白是一種DNA結(jié)合蛋白，該蛋白在細胞周期的G1期發(fā)揮檢查點（checkpoint）的功能，負責(zé)檢查染色體DNA是否有損傷，一旦發(fā)現(xiàn)有缺陷的DNA，它就刺激CIP(Cdkinteracting protein1)的表達，組織細胞進入細胞周期，并啟動DNA修復(fù)機制；若修復(fù)失敗，則啟動細胞凋亡機制。郭云良等[15]研究發(fā)現(xiàn)腦缺血后p53 ，12天達高峰,且表達P53蛋白的細胞損傷較重。研究表明[18，19]p53抑制劑具有神經(jīng)保護作用。 cfos和cjun cfos 、cjun是兩種原癌基因，屬于立早基因（IEG），其表達產(chǎn)物FOS和JUN蛋白是兩種轉(zhuǎn)錄因子，與核內(nèi)DNA結(jié)合，參與調(diào)節(jié)體內(nèi)許多過程如細胞周期、細胞分化、腫瘤轉(zhuǎn)化及細胞凋亡。腦缺血可以誘導(dǎo)cfos、cjun的表達。周珂等[20]利用大鼠大腦中動脈阻塞（MCAO）再灌注模型研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血4小時再灌注2小時后cfos、cjun表達陽性細胞增加，并與細胞凋亡呈正相關(guān)。cjun是由JNK1(cjun Nterminal kinase1)活化的，磷酸化的JNK1 （phosphoJNK）轉(zhuǎn)到核內(nèi)后才具有活化cjun的性質(zhì)，有實驗表明[21]暫時性MCAO后1小時, JNK1開始活化，8小時活性明顯增加；phosphoJNK在再灌注3小時仍陰性，8小時明顯增加，之后二者活性逐步增高，大多數(shù)細胞核均顯示明顯的陽性。 IAP與Smac/DIABLO IAP(inhibitors of apoptosis proteins) 家族是哺乳動物唯一的內(nèi)源性caspase抑制劑，它包括神經(jīng)元凋亡抑制蛋白（NAIP）、X染色體凋亡抑制劑（XIAP）、人凋亡抑制劑（hIAP）、survivin等，可特異性的抑制caspase9的活性，使始動caspase及效應(yīng)caspase均受抑制而達到抗凋亡目的。Smac(second mitochondriaderived of caspases)也稱DIABLO（direct IAP binding protein with low PI）, 是最近發(fā)現(xiàn)的一種線粒體膜蛋白，它可以通過抑制IAP間接激活caspases, 進而誘發(fā)細胞凋亡。Shibata 等[22]對暫時局部腦缺血后小鼠進行研究發(fā)現(xiàn)，線粒體內(nèi)Smac/DIABLO于再灌注2小時后開始增加，胞質(zhì)內(nèi)Smac/DIABLO 5小時后增加，細胞內(nèi)的XIAP也較正常組增多。 HSP 熱休克蛋白（HSP）分70KD家族、20KD家族、90KD家族。70KD家族時HSPs中最保守和最主要的一類。包括670、72及78Kp的HSPs,其中HSP70是缺血性腦損傷中研究最廣泛的一種，它作為分子伴侶參與維持蛋白質(zhì)分子恰當(dāng)構(gòu)型及自身穩(wěn)定性，并幫助那些可復(fù)性損傷的蛋白質(zhì)修復(fù)，還可提高細胞對應(yīng)激原的耐受。腦缺血可誘導(dǎo)HSP70蛋白的表達[23]，表達部位在梗死灶周圍,且表達的時間與細胞凋亡的時序基本吻合，可能與半暗區(qū)神經(jīng)元損傷的可逆性有關(guān)。對HSP70過度表達的轉(zhuǎn)基因小鼠的研究發(fā)現(xiàn)[24]，暫時性、局灶性以及全腦缺血后TUNEL陽性細胞較野生型小鼠減少。 磷酸化Akt Akt是絲氨酸蘇氨酸激酶，能夠防止凋亡的發(fā)生。Akt磷酸化后活化可以使Bad、caspase9等凋亡蛋白失活。Noshita等[25]用免疫組化和Western印記技術(shù)研究缺血后Akt發(fā)現(xiàn)，大鼠MCAO1小時后再灌注4小時缺血區(qū)皮質(zhì)磷酸化Akt顯著增加，但24小時后即開始下降，研究還發(fā)現(xiàn)缺血中心區(qū)磷