【正文】 通道阻斷劑不能出現(xiàn)這種結(jié)果，表明NMDA受體和電壓門控通道并不參與Aβ蛋白所引起的細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高，這種鈣離子的內(nèi)流可能是由于其它的機(jī)制所引起[13]。Aβ蛋白引起的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高是由于增加了細(xì)胞外的鈣離子內(nèi)流，而不是影響了細(xì)胞內(nèi)鈣庫的釋放[14]。Aβ可以在細(xì)胞膜上形成Ca2+通道，并且可以使毒蕈堿受體與G蛋白脫偶聯(lián)，導(dǎo)致磷脂酰肌醇的聚集和內(nèi)鈣的釋放，從而破壞了細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)。5．細(xì)胞內(nèi)鈣超載與細(xì)胞凋亡調(diào)控細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過程，與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。近年發(fā)現(xiàn),神經(jīng)退行性疾病患者的特定神經(jīng)組織具有細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征，提示細(xì)胞凋亡可能參與這些疾病的病變過程。神經(jīng)退行性疾病共同的病理特征是特定細(xì)胞群的進(jìn)行性丟失：AD患者表現(xiàn)為皮質(zhì)神經(jīng)元的丟失，PD患者表現(xiàn)為黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的丟失，ALS病人表現(xiàn)為脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元的嚴(yán)重退變，數(shù)量減少等。這些疾病的發(fā)生與氧化應(yīng)激、鈣中毒、線粒體缺陷、興奮性氨基酸損傷和生長因子缺乏有關(guān)，而這些因素均是神經(jīng)元凋亡的易感因素。凋亡早期的變化是細(xì)胞內(nèi)Ca2+快速持續(xù)的增加，這種增加主要來源于細(xì)胞外，是由于興奮性及非電壓依賴性鈣通道激活，使細(xì)胞外鈣內(nèi)流。Ca2+導(dǎo)致凋亡的機(jī)制可能與Ca2+激活內(nèi)源性核酸酶有關(guān)。Ca2+可通過活化核酸內(nèi)切酶，激活Ca2+CaM依賴性激酶Ⅱ，參與多種凋亡基因的調(diào)控。大量證據(jù)表明，在AD中觀察到的選擇性神經(jīng)元細(xì)胞丟失是細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡所引起。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在AD條件下海馬的CA1區(qū)大量細(xì)胞丟失，同時(shí)L型電壓敏感性鈣通道（LVSCCs）有所增加[15]。PD病理學(xué)表現(xiàn)為黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的選擇性丟失。BH4是一種內(nèi)源性的多巴胺合成的必需輔因子，對多巴胺生成細(xì)胞產(chǎn)生選擇性的毒性。體外實(shí)驗(yàn)顯示在BH4的作用下，細(xì)胞出現(xiàn)了如細(xì)胞固縮、染色體凝集等典型凋亡的一些超微結(jié)構(gòu)改變，使用TUNEL染色發(fā)現(xiàn)，BH4可以引起DNA斷裂。體內(nèi)研究同樣也出現(xiàn)了與之相一致的結(jié)果。而使用caspase抑制藥ZVADFMK 可以減少凋亡的發(fā)生。BH4還可以導(dǎo)致Bax/Bclx(L) mRNA 和蛋白水平的提高。Ca2+似乎在BH4導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要的作用，因?yàn)锽H4可以引起Ca2+吸收的增加，細(xì)胞內(nèi)鈣釋放的阻止劑和鈣螯合劑均能降低BH4的這一毒性[16]。鈣離子直接或間接影響了神經(jīng)元的許多生理、生化過程，在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要角色，但其確切機(jī)制尚不清楚。例如AD病人早期鈣離子濃度是降低的，晚期鈣離子濃度則有明顯的升高。所以，進(jìn)一步研究細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)控與神經(jīng)退行性疾病的關(guān)系，將有助于闡明神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制，有利于篩選適合治療此類疾病的藥物和探索新的治療途經(jīng)。參考文獻(xiàn)略。硝酸酯快速耐受性機(jī)制的研究進(jìn)展李妍，周聊生，孟彥，林琳（山東省千佛山醫(yī)院，濟(jì)南 250014）有機(jī)硝酸酯類藥物仍廣泛用于冠心?。òǚ€(wěn)定型和不穩(wěn)定型心絞痛及心肌梗死）和充血性心力衰竭等心血管疾病的治療中。這類藥物在體內(nèi)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，不斷釋放一氧化氮（NO），經(jīng)過一系列的生物學(xué)過程，最終引起血管平滑肌舒張及其他效應(yīng)。短期應(yīng)用時(shí)，硝酸酯類藥物能夠擴(kuò)張血管和對抗缺血癥狀，但其長期應(yīng)用時(shí)的療效因快速耐受性而受到質(zhì)疑，耐受性發(fā)生于連續(xù)使用的13日內(nèi)，這使其在臨床上的應(yīng)用受到一定限制。多年來，硝酸酯類藥物的耐受性機(jī)制一直在被廣泛地討論，同時(shí)發(fā)展了幾種學(xué)說，如巰基耗竭學(xué)說，神經(jīng)激素反饋激活學(xué)說，血容量擴(kuò)張學(xué)說、NO轉(zhuǎn)導(dǎo)過程障礙等，本文將就硝酸酯類藥物的作用機(jī)制與耐受機(jī)制作一綜述。1．硝酸酯類藥物的作用機(jī)制近20年來，對硝酸酯作用機(jī)制的研究已獲重大突破[1]。目前一般認(rèn)為其作用機(jī)制是硝酸酯在體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化，不斷釋放NO或S－亞硝基硫醇（SNO），NO和SNOs又激活靶酶——可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（soluble guanylyl cyclase, sGC），引起第二信使環(huán)一磷酸鳥苷（cGMP）的水平升高。cGMP在血管平滑肌上的一個(gè)重要的胞內(nèi)靶點(diǎn)是Ⅰ型cGMP依賴型蛋白激酶（cGKⅠ）， cGKⅠ是NO/cGMP通路中的一個(gè)重要的中介因子。NO的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)過程現(xiàn)已有了較為深入的研究[2]，認(rèn)為血管平滑肌同時(shí)表達(dá)兩種cGKⅠ異構(gòu)體α和β，每種異構(gòu)體都以同源二聚體形式存在（即α/α和β/β），每個(gè)亞基均含一個(gè)催化區(qū)域，2個(gè)cGMP結(jié)合點(diǎn)，這兩種異構(gòu)體僅在N端有結(jié)構(gòu)差異。體外實(shí)驗(yàn)證明，cGKⅠα能夠直接使Ca2+敏感的K+通道（BKCa）磷酸化，通過磷酸二酯酶的作用來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+水平[3]，使肌漿網(wǎng)再攝取Ca2+增多，胞漿Ca2+下降，最終導(dǎo)致血管平滑肌舒張等效應(yīng)。其生物轉(zhuǎn)化的場所主要在平滑肌細(xì)胞的漿膜，也有人認(rèn)為內(nèi)皮細(xì)胞漿膜也可能參與。目前，硝酸酯類藥物作用的分子學(xué)機(jī)制仍在討論之中，但大量研究證實(shí)了NO/cGMP/cGKⅠ這一學(xué)說的可信性[4,5]。也有人對NO是否參與硝酸酯的擴(kuò)張血管作用提出了質(zhì)疑[6]。這一實(shí)驗(yàn)運(yùn)用兩種新的方法在各種離體鼠和兔血管中檢驗(yàn)了硝酸甘油（glyceryl trinitrate, GTN）/NO這一假說：（1）用膠體Fe(DETC)2電刺激膈神經(jīng)呼吸旋轉(zhuǎn)捕獲法，（2）受血管擴(kuò)張劑刺激的磷蛋白的cGKⅠ－依賴型的磷酸化作用分析。作為對照，還研究了另一種硝酸酯類藥物－硝酸異山梨醇酯（ISDN）及內(nèi)皮依賴性的血管擴(kuò)張劑Ca2+ 載體A23187。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GTN具有很強(qiáng)的血管活性（擴(kuò)血管作用和磷酸化作用），但提供NO的能力較弱。對于脫羥腎上腺素預(yù)處理的主動脈，GTN（100nmol/L）,ISDN（100μmol/L），和A23187（1μmol/L）可引起幾乎完全的血管舒張（80％），而且磷酸化作用可達(dá)兩倍。與ISDN，和A23187相比，在給予治療濃度（101000nmol/L）的GTN時(shí)，沒有觀察到血管中NO明顯增多的現(xiàn)象。只有在超劑量給藥時(shí)（10μmol/L）才能觀察到血管NO合成水平顯著升高。因此，他們認(rèn)為GTN可激活sGC/cGMP/cGK1途徑而引起血管舒張，但這一過程并不受NO的介導(dǎo)。2．酯類藥物耐受性的定義、分類及檢測方法 定義人們認(rèn)識硝酸酯的耐受現(xiàn)象已一個(gè)多世紀(jì)了，最近30年來研究較為深入。硝酸酯耐受性是指患者持續(xù)應(yīng)用一定時(shí)間和一定劑量的硝酸酯制劑后，其抗心絞痛效應(yīng)、血流動力學(xué)效應(yīng)和抗血小板聚集效應(yīng)明顯降低，甚至恢復(fù)到治療前水平，或者須加大劑量才能維持其療效的一種狀態(tài)?！》诸愊跛狨サ哪褪苄愿鶕?jù)其機(jī)制不同可分為假性耐受和真性耐受。假性耐受是指因血管外因素所致的硝酸酯耐受現(xiàn)象，其機(jī)制為神經(jīng)激素反饋調(diào)節(jié)和血容量擴(kuò)張，發(fā)生在藥物治療早期；真性耐受是指血管自身因素所致的耐受現(xiàn)象。其機(jī)制主要為：（1）血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）對硝酸酯類轉(zhuǎn)化為NO的作用減低或消失；（2）VSMCs產(chǎn)生巰基受限或耗竭；（3）血管局部超氧陰離子產(chǎn)生增加；（4）血管局部內(nèi)皮素－1（ET1）分泌增加；（5）血管對交感神經(jīng)遞質(zhì)反應(yīng)性增加或NO介導(dǎo)性血管擴(kuò)張作用減弱?！≡u價(jià)方法莊漢屏等人[7]采用肱動脈血管二維超聲方法結(jié)合活動平板運(yùn)動試驗(yàn)對冠心病硝酸酯類的耐受性進(jìn)行了評價(jià)。證明外周肱動脈對硝酸酯類擴(kuò)血管反應(yīng)與冠心病運(yùn)動試驗(yàn)運(yùn)動誘發(fā)性ST段缺血型下移之和（ΣST）減少及運(yùn)動耐量改善相關(guān)。有研究報(bào)道，冠心病變異性心絞痛患者肱動脈與冠狀動脈對硝酸甘油的擴(kuò)血管反應(yīng)性相似。結(jié)果證實(shí)冠心病患者的肱動脈對硝酸酯類擴(kuò)血管反應(yīng)能夠在一定的程度上反映硝酸酯類抗心肌缺血的療效。3．硝酸酯耐受性（nitrate tolerance, NT）的機(jī)制硝酸酯耐受性的確切機(jī)制目前仍處于討論之中，目前認(rèn)為，耐受現(xiàn)象的機(jī)制可能涉及到多種因素，如神經(jīng)激素反饋激活機(jī)制（即所謂的假性耐受）、磷酸二酯酶1A1活性升高、sGC脫敏、反應(yīng)氧基團(tuán)（reactive oxygen species, ROS）產(chǎn)生增多、GTN生物轉(zhuǎn)化過程受阻等。早年提出的理論諸如硝酸酯血藥濃度下降學(xué)說、sGC脫敏學(xué)說等經(jīng)后來的研究被一一否定，以下是至今仍被人們認(rèn)可的部分理論：　巰基耗竭學(xué)說巰基耗竭學(xué)說認(rèn)為：硝酸酯在血管細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為NO或S亞硝基硫醇必須在有巰基(SH)的參與下才能進(jìn)行，長期持續(xù)使用硝酸酯使巰基不斷消耗以致細(xì)胞內(nèi)巰基耗竭，使轉(zhuǎn)化生成的NO量減少，從而產(chǎn)生耐受性。這一學(xué)說至今仍為部分人認(rèn)可，但近年來對該學(xué)說提出了質(zhì)疑，認(rèn)為雖然巰基參與硝酸酯的生物轉(zhuǎn)化，但是不一定參與硝酸酯耐受性的發(fā)生，巰基耗竭的可能性更小。Boesgaard等[8]發(fā)現(xiàn)持續(xù)經(jīng)導(dǎo)管恒量輸入NTG三天，當(dāng)大鼠發(fā)生低血壓效應(yīng)明顯減弱時(shí)，測得耐受大鼠血管巰基并未減少。研究發(fā)現(xiàn)[9]，含巰基的卡托普利和不含巰基的依那普利都可逆轉(zhuǎn)硝酸酯的耐受性。從目前已有的研究來看，巰基耗竭學(xué)說不能完全解釋硝酸酯耐受現(xiàn)象。 神經(jīng)激素反饋激活和血容量過大學(xué)說該學(xué)說認(rèn)為硝酸酯產(chǎn)生強(qiáng)大的血流動力學(xué)效應(yīng)，這種效應(yīng)會導(dǎo)致血漿腎素活性增強(qiáng)、兒茶酚胺水平增加、水鈉潴留和血容量增加，這些縮血管因素的加強(qiáng)和血容量增加便會削弱硝酸酯的擴(kuò)血管效應(yīng)而導(dǎo)致耐受性。早期許多研究者支持這一學(xué)說，但也有不支持這一學(xué)說的實(shí)驗(yàn)[10]，認(rèn)為神經(jīng)激素激活可能在充血性心衰的硝酸酯耐受方面占有一定地位，但在其他情況下的地位尚未確定。　超氧陰離子和內(nèi)皮素的作用有證據(jù)表明，長期使用NTG治療會促使氧自由基增多。Munzel[11]等認(rèn)為，血管壁超氧陰離子（O2）和ET1增多與硝酸酯耐受性密切相關(guān)。具體地說，持續(xù)硝酸酯療法反饋性激活神經(jīng)激素，包括腎素－血管緊張肽系統(tǒng)，引起血中血管緊張肽Ⅱ（AngⅡ）水平增加，AngⅡ激活血管壁生成O2的NADPH氧化酶，導(dǎo)致血管壁O2釋放增加。同時(shí)，AngⅡ誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞自分泌ET1。從NTG生物轉(zhuǎn)化生成NO與O2發(fā)生反應(yīng)生成ONOO而使NO失活，導(dǎo)致對平滑肌細(xì)胞的sGC刺激減少，最終使血管舒張能力下降。另一方面，增加的ET1作為一種蛋白激酶C的原發(fā)刺激因子，介導(dǎo)對縮血管物質(zhì)的高敏性。因此O2增加和ET1增加都可以減少NTG對血管的舒張能力，從而引起硝酸酯的耐受性。但是，Tomoya等做的實(shí)驗(yàn)對這一假說提出了質(zhì)疑[12]。他們用過度表達(dá)NO合成酶（eNOS）的轉(zhuǎn)基因鼠作動物模型，發(fā)現(xiàn)血管中超氧陰離子水平相對于控制組并未升高，顯示在eNOS轉(zhuǎn)基因鼠中，硝酸酯耐受性與超氧陰離子水平升高無關(guān)。 NO轉(zhuǎn)導(dǎo)過程受阻學(xué)說另有實(shí)驗(yàn)考察了在NO信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中血管緊張肽Ⅱ等因素的作用，認(rèn)為硝酸酯的耐受機(jī)制是NO/cGMP的作用過程受阻[13]。這一實(shí)驗(yàn)是將大鼠分為兩組，一組為血壓正常的控制組，另一組注射血管緊張肽Ⅱ（AngⅡ）（240mg/kg/h,持續(xù)28天），為高血壓組。使用NO供體時(shí)，高血壓組鼠的血管平滑肌細(xì)胞中Ca2+激活的K+通道表現(xiàn)出活性下降，且伴有硝酸酯耐受。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)只存在sGC異常這一個(gè)因素時(shí)并不能引起硝酸酯耐受。高血壓組鼠的外源性cGMP依賴性的蛋白激酶Ⅰ（cGKⅠ）活性沒有改變，提示沒有發(fā)生cGKⅠ水平下調(diào)。由于血管平滑肌細(xì)胞同時(shí)表達(dá)cGKⅠα和cGKⅠβ兩種異構(gòu)體，在同cGMP結(jié)合的過程中，cGKⅠα比cGKⅠβ更敏感，所以高血壓組鼠的cGKⅠ與cGMP結(jié)合力下降可能是因?yàn)閏GKⅠα與cGKⅠβ的相對數(shù)量發(fā)生了改變。結(jié)果顯示，高血壓組鼠在注射血管緊張肽Ⅱ4天之后，雖血壓尚未升高，但可檢出血管平滑肌細(xì)胞的cGKⅠβmRNA大幅上升，而cGKⅠαmRNA下降。這一實(shí)驗(yàn)提示了在NO/cGMP轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中AngⅡ?qū)GKⅠ的作用[14]。 sGC活性降低和cGMP依賴性的蛋白激酶（PKG）蛋白水平降低學(xué)說Tomoya等在否定了內(nèi)皮超氧陰離子升高、NO的生物轉(zhuǎn)化過程障礙、磷酸二酯酶1A1活性升高等學(xué)說之后，提出了新的耐受機(jī)制。他們認(rèn)為硝酸酯的耐受性至少存在2個(gè)內(nèi)在機(jī)制：一個(gè)是sGC活性降低，另一個(gè)是PKG蛋白水平降低[12]。這一學(xué)說基于以下實(shí)驗(yàn)：制作過度表達(dá)牛內(nèi)皮eNOS基因的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，用血漿亞硝酸鹽和硝酸鹽分析儀（臭氧化學(xué)熒光儀）來檢驗(yàn)亞硝酸鹽的量，以此估測體外主動脈中NO的釋放水平，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因小鼠的主動脈NO釋放增加，且血漿亞硝酸鹽和硝酸鹽水平也高于控制組；對KCL和前列腺素F2α收縮反應(yīng)顯著低于控制組；對cGMP反應(yīng)顯著降低；sGC活性、PKG水平和活性也呈現(xiàn)降低趨勢。上述結(jié)果提示，NO的過度釋放會導(dǎo)致NO/cGMP/PKG介導(dǎo)的血管擴(kuò)張作用過程受阻。而且，sGC活性降低這一個(gè)因素并不能很好地解釋血管反應(yīng)下降的現(xiàn)象，因?yàn)轶w外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均顯示，持續(xù)應(yīng)用硝酸酯類藥物可降低血管平滑肌細(xì)胞中PKG的轉(zhuǎn)錄，從而降低PKG蛋白的水平，所以PKG蛋白水平降低也可能是導(dǎo)致耐受性的一個(gè)機(jī)制?！【€粒體功能障礙學(xué)說近來研究顯示，線粒體中的醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase, ALDH2)在硝酸甘油的體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化過程中起重要作用[15]。在線粒體中，ALDH2將GTN催化為1，2－二硝酸甘油酯（1,2GDN）和亞硝酸鹽，如果ALDH2受到抑制，GTN的血管擴(kuò)張作用就受到阻滯。Karsten Sydow等人所作的動物實(shí)驗(yàn)[16]報(bào)道了GTN的耐受性與血管中ALDH2的活性受阻、GTN代謝下降及線粒體產(chǎn)生ROS增多有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)用大鼠連續(xù)使用3天GTN（3ds, ）建立耐受模型，可見血管ALDH2活性、GTN的生物轉(zhuǎn)化、cGKⅠ的活性均有所下降。而且，對照組中多種ALDH2抑制劑和底物（如氰酰胺、乙醛、水合氯醛）都能降低血管中的cGKⅠ水平和GTN的擴(kuò)血管活性，而耐受組中卻幾乎沒有發(fā)生此類作用。在GTN引發(fā)的體外耐受性模型中，可見ALDH2的活性和GTN轉(zhuǎn)化為1，2GDN的過程均受到抑制，但體內(nèi)的相關(guān)機(jī)制仍待證實(shí)。另外，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)都顯示，GTN可降低主動脈和心臟中線粒體ALDH的活性，同時(shí)提高線粒體產(chǎn)生ROS的能力。抗氧化劑或還原劑可降低線粒體制造ROS的能力，還可恢復(fù)ALDH2的活性。這一實(shí)驗(yàn)證明，應(yīng)用GTN可致：（1）GTN在線粒體中的生物轉(zhuǎn)化下降；（2）線粒體中ROS產(chǎn)生增多；（3）cGKⅠ活性下降；（4）內(nèi)皮功能障礙。線粒體中ALDH2功能下降和ROS產(chǎn)生增多與硝酸酯的耐受性及交叉耐受性均有關(guān)聯(lián)?？傊?，線粒體功能障礙是硝酸酯耐受