生物化學(xué)簡(jiǎn)明教程第二章蛋白質(zhì)-資料下載頁(yè)
2025-06-07 20:45本頁(yè)面
【正文】 淀是分離和純化蛋白質(zhì)的基本方法，如等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等。◇不可逆沉淀(1)在強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水。(2)由于沉淀過(guò)程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，所以又稱為變性沉淀。(3)如加熱沉淀、強(qiáng)酸、堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。8. 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：考馬斯亮藍(lán)G250法，紫外吸收法，凱氏定氮法，其它方法。9. 蛋白質(zhì)的紫外吸收：由于蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長(zhǎng)處有特征性吸收峰。蛋白質(zhì)的OD280與其濃度呈正比關(guān)系，因此可作蛋白質(zhì)定量測(cè)定。①鹽析(salt precipitation)是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。②使用丙酮沉淀時(shí)，必須在0～4℃低溫下進(jìn)行，丙酮用量一般10倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。2. 根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小進(jìn)行分離①透析及超濾法：(dialysis):利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開(kāi)的方法。:應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過(guò)有一定截留分子量的超濾膜，達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。②層析法③凝膠過(guò)濾(gel filtration)又稱分子篩層析，利用各蛋白質(zhì)分子大小不同分離。④離子交換層析：利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進(jìn)行分離。3. 根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進(jìn)行分離蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場(chǎng)中能向正極或負(fù)極移動(dòng)。這種通過(guò)蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中泳動(dòng)而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù), 稱為電泳(elctrophoresis) 。根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。 *SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定。*等電聚焦電泳，通過(guò)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。*雙向凝膠電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)。4. 根據(jù)配體特異性進(jìn)行分離親和層析法:親和層析利用待分離物質(zhì)和它的特異性配體間具有特異的親和力，從而達(dá)到分離的目的。：a、樣品必須是均一的，純度應(yīng)在97%以上；b、知道蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量，其誤差允許在10%左右。：(1)測(cè)定末端氨基酸數(shù)目，確定蛋白質(zhì)分子是由幾條肽鏈構(gòu)成的；(2)拆分蛋白質(zhì)分子的多肽鏈，斷開(kāi)多肽鏈內(nèi)二硫鍵并分離出每條肽鏈。(3)將肽鏈完全水解，測(cè)定每條多肽鏈的氨基酸組成(4)鑒定多肽鏈N－末端、C－末端氨基酸殘基 (5)至少用兩種方法將多肽鏈水解成較小的片段； (6)分離并測(cè)定各肽段的氨基酸序列；(7)片段重疊法重建完整多肽鏈一級(jí)結(jié)構(gòu)； (8)確定半胱氨酸殘基間形成二硫鍵交聯(lián)橋的位置。：①多肽鏈的分離：如果蛋白質(zhì)含有一條以上的肽鏈，須分離純化各肽鏈。試劑：8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍或高濃度鹽②拆分蛋白質(zhì)的多肽鏈，斷開(kāi)多肽鏈內(nèi)二硫鍵,方法如下:⑴過(guò)甲酸氧化法：用過(guò)甲酸氧化，使胱氨酸部分氧化成2個(gè)半胱氨磺酸。⑵還原法：幾條多肽鏈通過(guò)二硫鍵交聯(lián)在一起?？稍?mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過(guò)量的β巰基乙醇（或二硫蘇糖醇）處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑（ICH2COOH）保護(hù)生成的巰基，以防止它重新被氧化。⑶Cleland試劑的還原作用③分析每一條多肽鏈的氨基酸組成：經(jīng)分離、純化的多肽鏈一部分樣品進(jìn)行完全水解，測(cè)定它的氨基酸組成，并計(jì)算出氨基酸成分的分子比或各種殘基的數(shù)目。常用6mol/LHCl水解蛋白質(zhì)。④鑒定多肽鏈N－末端殘基：方法:Sanger法（二硝基氟苯反應(yīng)），DNS法（丹磺酰氯反應(yīng)），Edman法（異硫氰酸苯脂反應(yīng)），氨肽酶法。⑤C－末端分析方法：肼解法，羧肽酶法（羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它專一地從肽鏈的C端依次切下一個(gè)氨基酸殘基，釋放出游離的氨基酸。），LiBH4還原法。⑥裂解多肽鏈成較小的片段：酶解法：如：胰蛋白酶（Lys和Arg側(cè)鏈專一性較強(qiáng)，水解速度快。Pro水解受抑。），糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶，胰凝乳蛋白酶（Phe, Trp,Tyr時(shí)水解快。Leu，Met和His水解稍慢。）化學(xué)法（可獲得較大的肽段）：溴化氰法（能選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵。），羥胺法（專一性斷裂AspGly之間的肽鍵。也能部分裂解AsnLeu之間的肽鍵以及AsnAla之間的肽鍵。）●常用的斷裂多肽鏈的方法：溴化氰裂解法：專一性水解Met的羧基端；胰蛋白酶水解法：專一性水解Lys、Arg的羧基端；胰凝乳蛋白酶水；解法：專一性水解Tyr、Phe、Trp的羧基端； 胃蛋白酶水解法：專一性斷裂鍵兩端都是疏水氨基酸；金黃色葡萄球菌蛋白酶水解法：專一性水解Glu、 Asp的羧基端； 梭狀芽孢桿菌蛋白酶水解法：專一性水解Arg的羧基端。⑦肽段氨基酸序列的測(cè)定：Edman降解法，質(zhì)譜法，通過(guò)核酸來(lái)推演蛋白質(zhì)中的氨基酸序列⑧肽段的拼接：將兩套不同肽段的氨基酸順序進(jìn)行比較，以獲得完整的蛋白質(zhì)分子的氨基酸順序。⑨確定半胱氨酸殘基間形成二硫鍵交聯(lián)橋的位置： 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的順序測(cè)定完成后，將未拆開(kāi)二硫鍵的同一種蛋白質(zhì)再一次進(jìn)行專一性的酶解，由此就可以確定完整的蛋白質(zhì)中二硫鍵的位置。方法：采用胃蛋白酶水解：切點(diǎn)多，生成的肽段包括含二硫鍵的肽段都比較?。凰嵝原h(huán)境下防止二硫鍵發(fā)生交換，二硫鍵穩(wěn)定。將所得的肽段利用對(duì)角線電泳技術(shù)進(jìn)行分離。然后同其它方法分析的肽段進(jìn)行比較，確定二硫鍵的位置。
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