【正文】 變性后的蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上雖有改變，但組成成分和相對(duì)分子質(zhì)量不變。 E、蛋白質(zhì)的復(fù)性 定義： 如果引起變性的因素 比較溫和 ，蛋白質(zhì)構(gòu)象僅僅是有些松散時(shí)，當(dāng)除去變性因素后，可根據(jù)熱力學(xué)原理緩慢地重新自發(fā)折疊恢復(fù)原來(lái)的構(gòu)象，這種現(xiàn)象稱作復(fù)性 。 核糖核酸酶變性與復(fù)性作用 天然狀態(tài)，有催化活性 非折疊狀態(tài)，無(wú)活性 8 M 尿素 ?巰基乙醇 變性 天然狀態(tài) –SS鍵恢復(fù) 而且是正確配對(duì) 如：－ NH3＋ 、－ COO－ 、－ OH、 SH、 CONH等，它們都具有高度的親水性，當(dāng)與水接確時(shí)，極易吸附水分子，使蛋白質(zhì)顆粒外圍形成一層水化膜，將顆粒彼此隔開(kāi)，不致因互相碰撞凝聚而沉淀。 (四 )蛋白質(zhì)膠體性質(zhì) 由于蛋白質(zhì)分子量很大，在水溶液中形成直徑 1100nm之間的顆粒，已達(dá)到膠體顆粒范圍的大小，因而具有膠體溶液的通性。 蛋白質(zhì)的水溶液能形成穩(wěn)定的親水膠體的原因： １、蛋白質(zhì)多肽鏈上含有許多極性基團(tuán)。 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在非等電狀態(tài)時(shí)，相同蛋白質(zhì)顆粒帶有同性電荷， 與周圍的反離子構(gòu)成穩(wěn)定的 雙電層 。 使蛋白質(zhì)顆粒之間相互排斥，保持一定距離，不致互相凝聚而沉淀。 蛋白質(zhì)溶液由于具有 水化層 與 雙電層 兩方面的穩(wěn)定因素，所以作為膠體系統(tǒng)是相對(duì)穩(wěn)定的。 參見(jiàn) p54 蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)的應(yīng)用 由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過(guò) 半透膜 ，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去。 透析法： 以半透膜提純蛋白質(zhì)的方法叫透析法 半透膜： 只允許溶劑小分子通過(guò)，而溶質(zhì)大分子不能通過(guò)，如羊皮紙、火棉膠、玻璃紙等 (五 )蛋白質(zhì)的沉淀 蛋白質(zhì)在溶液中的穩(wěn)定性是有條件的 、相對(duì)的 。 如果加入適當(dāng)?shù)脑噭┦沟鞍踪|(zhì)分子處于 等電點(diǎn)狀態(tài) 或 失去水化層 （ 消除相同電荷 ， 除去水膜 ） ， 蛋白質(zhì)膠體溶液就不再穩(wěn)定并將產(chǎn)生沉淀 。 定義： 蛋白質(zhì)在溶液中靠水膜和電荷保持其穩(wěn)定性，水膜和電荷一旦除去，蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性就被破壞，蛋白質(zhì)就會(huì)從溶液中沉淀下來(lái)，此現(xiàn)象即為 蛋白質(zhì)的沉淀作用。 參見(jiàn) p54 1 可逆沉淀 ?定義： 在 溫和條件下 ，通過(guò)改變?nèi)芤旱膒H或電荷 狀況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分離。 ? 在沉淀過(guò)程中， 結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒(méi)有發(fā)生變化 ，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為 非變性沉淀。 ? 可逆沉淀是分離和純化蛋白質(zhì)的基本方法，如 等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法 等。 (1)鹽析 在蛋白質(zhì)的水溶液中，加入大量 高濃度 的強(qiáng)電解質(zhì)鹽 如硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等，可破壞蛋質(zhì)分子表面的水化層，中和它們的電荷，因而使蛋白質(zhì)沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為 鹽析 。 而 低濃度 的鹽溶液加入蛋白質(zhì)溶液中，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度增加，該現(xiàn)象稱為 鹽溶 。 鹽析的機(jī)理 ： 破壞蛋白質(zhì)的水化膜，中和表面的凈電荷 。 鹽析法是最常用的蛋白質(zhì)沉淀方法，該方法不會(huì)使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性 。 各種蛋白質(zhì)的親水性及荷電性均有差別，因此不同蛋白質(zhì)所需中性鹽濃度也有不同，只要調(diào)節(jié)中性鹽濃度，就可使混合蛋白質(zhì)溶液中的幾種蛋白質(zhì)分散沉淀析出，這種方法稱為 分段鹽析 。 (2)弱酸或弱堿沉淀法 (等電點(diǎn)沉淀） 用弱酸或弱堿調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的 pH處于等電點(diǎn)處 ， 使蛋白質(zhì)沉淀。 弱酸或弱堿沉淀法機(jī)理 ： 破壞蛋白質(zhì)表面凈電荷 。 酸 酸 堿 堿 堿 酸 溶液中蛋白質(zhì)的聚沉 (3) 有機(jī)溶劑沉淀法 ： 在蛋白質(zhì)溶液中，加入能與水互溶的有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮等，蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀。 有機(jī)溶劑沉淀法的機(jī)理 ： 破壞蛋白質(zhì)的水化膜 。 注意： 有機(jī)溶液沉淀蛋白質(zhì)通常在 低溫條件下進(jìn)行，否則有機(jī)溶劑與水互溶產(chǎn)生的溶解熱會(huì)使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性。 2 不可逆沉淀 ?定義： 在強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也 破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì) ，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水。 ?由于沉淀過(guò)程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，所以又稱為 變性沉淀。 ?如 加熱沉淀 （次級(jí)鍵） 、強(qiáng)酸堿沉淀 （影響電荷） 、重金屬鹽沉淀（ Hg2+、 Pb2+ 、 Cu2+、 Ag2+）和生物堿試劑或某些酸類沉淀 等都屬于不可逆沉淀。 (1)重金屬鹽沉淀 (條件： pH 稍大于 pI為宜 ) 當(dāng) pH 稍大于 pI時(shí)， 蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷這樣就容易與重金屬離子結(jié)合成不溶性鹽而 沉淀。 重金屬沉淀法的機(jī)理 ： 重金屬鹽加入之后，與帶負(fù)電的羧基結(jié)合 。 (2)生物堿試劑沉淀法 （條件： pH稍小于 pI） 生物堿 是植物組織中具有顯著生理作用的一類含氮 的堿性物質(zhì)。 能夠沉淀生物堿的試劑稱為 生物堿試劑 。 生物堿試劑一般為 弱酸性物質(zhì) ，如單寧酸、苦味酸、三氯乙酸等。 生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)的機(jī)理 ： 在酸性條件下，蛋白質(zhì)帶正電，可以與生物堿試劑的酸根離子結(jié)合而產(chǎn)生沉淀 。 例如： “ 柿石癥 ” (3)加熱變性沉淀法 幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固 。 少量鹽促進(jìn)蛋白質(zhì)加熱凝固 。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點(diǎn)時(shí)，加熱凝固最完全和最迅速 . 如： 煮雞蛋 (六 ) 蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) (自學(xué) ) 雙縮脲反應(yīng) 酚試劑反應(yīng) 蛋白質(zhì)定量 、 定性 茚三酮反應(yīng) 測(cè)定常用方法 另外還有： 蛋白黃色反應(yīng)、米倫氏反應(yīng)、乙醛酸反應(yīng) 等。 參見(jiàn) p55 雙縮尿在堿性溶液中能與硫酸銅發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生紅紫色絡(luò)合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。 (堿性溶液 ) Cu2+ 紅紫色絡(luò)合物 180176。 C 雙縮脲反應(yīng) 蛋白質(zhì)在遠(yuǎn)紫外光區(qū) （ 200230nm）有較大的吸收 ， 在280nm有一特征吸收峰 ， 可利用這一特性對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性定量鑒定 。 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度 /（ mg/ml） = 280 260 測(cè)定范圍： ～ (七 ) 蛋白質(zhì)的含量測(cè)定 (自學(xué) ) 考馬斯亮藍(lán)染色法、紫外吸收法、凱氏定氮法等 參見(jiàn) p5556 本章總結(jié) 1. 蛋白質(zhì)的分類。 蛋白質(zhì)的功能 2. 蛋白質(zhì)的組成（元素組成、化學(xué)組成）及蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 3. 20種氨基酸的 結(jié)構(gòu) 、 分類 及名稱（ 三字縮寫符 、單字縮寫符） 4. 氨基酸的 重要理化性質(zhì) ：兩性解離、 茚三酮 顯色、與 2,4二硝基氟苯（ DNFB）反應(yīng)、 與異硫氰酸苯酯（ PITC）的反應(yīng) 5. 蛋白質(zhì)的 一級(jí)結(jié)構(gòu) ：肽、肽鍵、活性多肽及一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定 6. 蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)： 二級(jí)結(jié)構(gòu) 單元（ ?螺旋、 ?折疊、 ?轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)卷曲）、 三級(jí)與四級(jí)結(jié)構(gòu) （超二級(jí)結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域、亞基）及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 7. 蛋白質(zhì)的性質(zhì)：大分子性質(zhì)、蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定（離心法、凝膠過(guò)濾法、 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法）、 兩性電離 （等電點(diǎn)、電泳、離子交換）、 膠體性質(zhì)、蛋白質(zhì)沉淀 （可逆沉淀、不可逆沉淀）、 蛋白質(zhì)變性 、紫外吸收及顏色反應(yīng) 8. 蛋白質(zhì)的分離、分析技術(shù) 課外作業(yè) P6162思考題 ：