【正文】 能切割 小結(jié) : 蛋白質(zhì)的末端分析（ N、 C端） N末端分析 二硝基氟苯（ FDNB）法 Edman降解法 丹磺酰氯（ DNSCl）法 氨肽酶法 C末端分析 肼解法 羧肽酶 測定步驟 （ 6） 多肽鏈斷裂成多個(gè)肽段 可采用兩種或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離開來。 A1 A2 A3 A4 B1 B2 B3 ? 酶解法 : 胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶 多肽鏈的選擇性降解 ? 化學(xué)法： 溴化氰，羥胺 ? Trypsinase ： R1=Lys和 Arg側(cè)鏈（專一性較強(qiáng)，水解速度快）。R2=Pro 水解受抑。 N H C H COR 4N H C H COR 3N H C H COR 2N H C H COR 1肽鏈 水解位點(diǎn) 胰蛋白酶 ? 或胰凝乳蛋白酶（ Chymotrypsin）： R1=Phe, Trp, Tyr。 Leu， Met和His水解稍慢。 ? R2=Pro 水解受抑。 N H C H COR 4N H C H COR 3N H C H COR 2N H C H COR 1肽鏈 水解位點(diǎn) 糜蛋白酶 ? Pepsin： R1和 R2＝Phe, Trp, Tyr。 Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度較快。 ? R1=Pro 水解受抑。 N H C H COR 4N H C H COR 3N H C H COR 2N H C H COR 1肽鏈 水解位點(diǎn) 胃蛋白酶 ? thermolysin： R2=Phe, Trp, Tyr。 Leu，Ile, Met以及其它疏水性強(qiáng)的氨基酸水解速度較快。 ? R2=Pro或 Gly 水解受抑。 N H C H COR 4N H C H COR 3N H C H COR 2N H C H COR 1肽鏈 水解位點(diǎn) 嗜熱菌蛋白酶 ? 分別從肽鏈羧基端和氨基端水解 N H C H COR 4N H C H COR 3N H C H COR 2N H C H COR 1肽鏈 水解位點(diǎn) 羧肽酶和氨肽酶 ? 谷氨酸蛋白酶： R1=Glu、 Asp(磷酸緩沖液 ) R1=Glu (磷酸緩沖液或醋酸緩沖液 ) ? 精氨酸蛋白酶： R1=Arg N H C H COR 4N H C H COR 3N H C H COR 2N H C H COR 1肽鏈 水解位點(diǎn) 谷氨酸蛋白酶和精氨酸蛋白酶 化學(xué)法： 可獲得較大的肽段 溴化氰 (Cyanogen bromide)水解法，它能選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵。 C H3S ：C H2C H2C HN H C N H C H CO OR+ B r C+NB rC H3S+C H2C H2C HN H C N H C H CO ORC NC H3S C N C H2C HN H C N H C H CO ORC H2+H2O+C H2C HN H COC H2O H3N+C H COR高絲氨酸內(nèi)酯 羥胺（ NH2OH）： 專一性斷裂 AsnGly之間的肽鍵。也能部分裂解 AsnLeu之間的肽鍵以及 AsnAla之間的肽鍵。 一級(jí)結(jié)構(gòu)測定步驟 Edman 法 （ 1） 測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目 （ 2）拆分蛋白質(zhì)分子中的多肽鏈 （ 3）斷裂多肽鏈內(nèi)的二硫鍵 （ 4） 測定多肽鏈的氨基酸組成 （ 5） 分析多肽鏈的 N末端和 C末端 （ 6）多肽鏈部分裂解成肽段 （ 7）測定各個(gè)肽段的氨基酸順序 （ 8）確定肽段在多肽鏈中的順序 （ 9）確定多肽鏈中二硫鍵的位置 蛋白質(zhì)測序方法 ? 氨基酸序列分析儀 化學(xué)測序 （ Edman反應(yīng)原理） ? 酶降解法 （氨肽酶、羧肽酶） ? 質(zhì)譜法 （ MS） — 首先修飾肽鏈中的極性基團(tuán)，如 氨基的乙?；ù姿狒?OH、 COOH等的甲基化（ CH3I）。經(jīng)質(zhì)譜儀獲得蛋白質(zhì)的氣相離子 MS/MS測序一般在 25AA左右 適于微量多肽 1012mol ? 根據(jù)核苷酸序列推定法 用待測蛋白作抗原免疫動(dòng)物獲得抗體，用抗體沉淀合成此蛋白的核糖體，從中分離 mRNA?cDNA ?推測蛋白質(zhì)序列 電噴射電離 利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯(cuò)重疊 （跨切口重疊） ，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。 一級(jí)結(jié)構(gòu)測定步驟 （ 1） 測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目 （ 2）拆分蛋白質(zhì)分子中的多肽鏈 （ 3）斷裂多肽鏈內(nèi)的二硫鍵 （ 4） 測定多肽鏈的氨基酸組成 （ 5） 分析多肽鏈的 N末端和 C末端 （ 6）多肽鏈部分裂解成肽段 （ 7）測定各個(gè)肽段的氨基酸順序 （ 8）確定肽段在多肽鏈中的順序 （ 9）確定多肽鏈中二硫鍵的位置 A法水解得到四個(gè)小肽： A1 AlaPhe A2 GlyLysAsnTyr A3 ArgTyr A4 HisVal 重疊結(jié)構(gòu)拼湊情況： A1 AlaPhe B1 AlaPheGlyLys A2 GlyLysAsnTyr B2 AsnTyrArg A3 ArgTyr B3 Tyr HisVal A4 HisVal B法水解得到 3個(gè)小肽： B1 AlaPheGlyLys B2 AsnTyrArg B3 Tyr HisVal 一級(jí)結(jié)構(gòu)測定步驟 （ 1） 測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目 （ 2）拆分蛋白質(zhì)分子中的多肽鏈 （ 3）斷裂多肽鏈內(nèi)的二硫鍵 （ 4） 測定多肽鏈的氨基酸組成 （ 5） 分析多肽鏈的 N末端和 C末端 （ 6）多肽鏈部分裂解成肽段 （ 7）測定各個(gè)肽段的氨基酸順序 （ 8）確定肽段在多肽鏈中的順序 （ 9）確定多肽鏈中二硫鍵的位置 ? 一般采用胃蛋白酶處理含有二硫鍵的多肽鏈 (切點(diǎn)多；酸性環(huán)境下防止二硫鍵發(fā)生交換 )。 ? 將所得的肽段利用 Brown及 Hartlay的對(duì)角線電泳技術(shù)進(jìn)行分離。 ? 然后同其它方法分析的肽段進(jìn)行比較，確定二硫鍵的位置。 + + 第二向 第一向 a b Brown和 Hartlay對(duì)角線電泳圖解 圖中 a、 b兩個(gè)斑點(diǎn)是由一個(gè)二硫鍵斷裂產(chǎn)生的肽段 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測序的意義 ? 判斷蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu) ? 洞悉蛋白質(zhì)功能 ? 有助于疾病診斷與治療 ? 蛋白質(zhì)具有一條或數(shù)條多肽鏈 ,但并不是松散的。 ? 而是在三維空間上有特定的走向和排布，即有特定的空間結(jié)構(gòu)（三維結(jié)構(gòu)），這種空間結(jié)構(gòu)就是蛋白質(zhì)的構(gòu)象。 二、 蛋白質(zhì)的構(gòu)象 二、 蛋白質(zhì)的構(gòu)象 （一）構(gòu)型與構(gòu)象 ：是指不對(duì)稱碳原子上相連的各原子或取 代基團(tuán)的空間排布。構(gòu)型的轉(zhuǎn)變必定伴 隨著共價(jià)鍵的斷裂和重組。 ：指相同構(gòu)型的化合物中，與碳原子相連 的各原子或取代基團(tuán)在單鍵旋轉(zhuǎn)時(shí)形成 的相對(duì)空間排布。構(gòu)象的改變不需要共 價(jià)鍵的斷裂。 二、 蛋白質(zhì)的構(gòu)象 （二）蛋白質(zhì)的構(gòu)象 蛋白質(zhì)的構(gòu)象即蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，是指在一 級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，蛋白質(zhì)分子的多肽鏈按一定方式 折疊、盤繞或組裝成特有的空間結(jié)構(gòu)。 肽鍵 （ peptide bond） ? 肽鍵的特點(diǎn)是氮原子上的孤對(duì)電子與羰基具有明顯的共軛作用 。 肽鍵中的 CN鍵具有部分雙鍵性質(zhì) ， 不能自由旋轉(zhuǎn) 。 在大多數(shù)情況下 ， 以反式結(jié)構(gòu)存在 。 ? 組成肽鍵的原子處于同一平面 。 C=N 鍵長 = CN 肽平面： 構(gòu)成肽鍵的四個(gè)原子（ C、 O、 N、 H）和與 之相連的兩個(gè) α 碳原子都處在同一個(gè)平面 內(nèi)，此剛性結(jié)構(gòu)的平面稱肽平面或酰氨平 面。 相鄰的肽平面構(gòu)成二面角 酰胺平面與 α碳原子的二面角（ φ和 ψ ） 二面角 兩相鄰酰胺平面之間 ， 能以共同的 Cα為定點(diǎn)而旋轉(zhuǎn) ， 繞 CαN鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱 φ角 ， 繞 CCα鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱 ψ角 。 φ和 ψ稱作二面角 ， 亦稱構(gòu)象角 。 完全伸展的多肽主鏈構(gòu)象 α碳原子 酰胺平面 Φ=1800， ψ=1800 Φ=00， ψ=00的多肽主鏈構(gòu)象 酰胺平面 Φ=00， ψ=00 側(cè)鏈 非鍵合原子接觸半徑 從理論上講，蛋白質(zhì)中的所有 Cα C和 Cα N單鍵都能自由旋轉(zhuǎn)而形成無數(shù)構(gòu)象，但天然蛋白質(zhì)分子中只存在少數(shù)構(gòu)象，其原因是： 肽平面只能以 Cα 為頂點(diǎn)旋轉(zhuǎn)； 分子中的原子以反式排列最為穩(wěn)定； R側(cè)鏈基團(tuán)的空間位阻效應(yīng)。 三、蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu) ? 蛋白質(zhì)的二級(jí) (Secondary)結(jié)構(gòu)是指肽鏈的 主鏈 在空間的排列 ,或規(guī)則的幾何走向、旋轉(zhuǎn)及折疊。它只涉及肽鏈主鏈的構(gòu)象及鏈內(nèi)或鏈間形成的氫鍵。 ? 主要有 ?螺旋、 ?折疊、 ?轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲。 ? 維系蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的力： 氫鍵 ?α 螺旋結(jié)構(gòu)是 Pauling等人 1951年提出的。 ?二面角： Φ= 57176。 Ψ= 47176。 ?是蛋白質(zhì)中最常見、含量最豐富的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在球狀及纖維狀蛋白質(zhì)中廣泛存在。 α 螺旋 （ α － helix） 特征 ： 每隔 AA殘基 螺 旋 上 升 一 圈 ， 螺距。兩個(gè)氨基酸之間的距離為 。 2 、 螺旋體中所有氨基酸殘基 R側(cè)鏈都伸向外側(cè) ，鏈中的全部 C=O 和 NH幾乎都平行于螺旋軸 。 每個(gè)氨基酸殘基的NH與前面第四個(gè)氨基酸殘基的 C=O形成氫鍵 ， 肽鏈上所有的肽鍵都參與氫鍵的形成 。 多肽鏈中存在脯氨酸時(shí) ， α螺旋中斷 ， 并產(chǎn)生一個(gè) “ 結(jié)節(jié) ” （ 1） α－螺旋（ α－ helix） HNCO HOCH CH2 CH2 CH2 ? ? ? ? ?=57?、 ?=48? 形成因素 ：與ＡＡ組成和排列順序直接相關(guān)。 多態(tài)性 ：多數(shù)為右手 （ 較穩(wěn)定 ） ， 亦有少數(shù)左手螺旋存在 （ 不穩(wěn)定 ） ；存在尺寸不同的螺旋 。 常用 代表 α 螺旋， ， 13表示氫鍵封閉的環(huán)內(nèi)含有 13個(gè)原子。 其它螺旋形式： 310螺旋和 π 螺旋（ — 螺旋） righthanded helix lefthanded helix R側(cè)鏈對(duì) α 螺旋的影響 : R側(cè)鏈的大小和帶電性決定了能否形成 α 螺旋以及形成的 α 螺旋的穩(wěn)定性。 ① 多肽鏈上連續(xù)出現(xiàn)帶同種電荷基團(tuán)的氨基酸 殘基，則由于靜電排斥，不能形成鏈內(nèi)氫鍵，從而不能形成穩(wěn)定的 α 螺旋。 ② Gly的 Φ 角和 Ψ 角可取較大范圍，在肽中連續(xù)存在時(shí)，使形成 α 螺旋所需的二面角的機(jī)率很小，不易形成 α 螺旋。 ③ R基大（如 Ile）不易形成 α 螺旋 ④ Pro中止 α 螺旋。 ⑤ R基較小，且不帶電荷的氨基酸利于α 螺旋的形成。 （ 2