生物化學(xué)合工大第二章蛋白質(zhì)化學(xué)-資料下載頁
2025-01-16 11:52本頁面
【正文】 心 它的密度 。 ， 即停止不前 。 ， 各種蛋白質(zhì)在不同密度介 質(zhì)中形成獨(dú)立的區(qū)帶 。 3. 凝膠過濾 ，是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì) 混合物最有效的方法之一。 （商品名為 Sephadex)和瓊脂糖凝 膠（商品名為 Sepharose）。 — 用交聯(lián)劑與葡聚糖或瓊脂糖的比 例來實(shí)現(xiàn) ，小分子后洗下來。 凝膠過濾法 （ 二 ） 利用溶解度差別的分離方法 1. 等電點(diǎn)沉淀 利用各種蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí) ， 溶解度最小 這一性質(zhì) ， 可以通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的 PH 值 ， 將不同的蛋白質(zhì)分開 。 2. 鹽溶和鹽析 鹽溶：低濃度的中性鹽在蛋白質(zhì)分子表面形成雙電層 ， 使蛋白質(zhì)溶解度增加； 鹽析：高濃度的中性鹽破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層 ， 使蛋白質(zhì)溶解度降低 ， 發(fā)生沉淀析出 。 分段鹽析 ：不同蛋白質(zhì)鹽析所需的鹽濃度不同 ， 蛋白質(zhì)溶液中 ， 逐漸增大鹽濃度 ， 不同蛋白質(zhì)先后析出 ， 稱分段鹽析 。 a 有機(jī)溶劑 （ 與水相溶 ） 爭取蛋白質(zhì)顆粒上的水 膜 ， 使之沉淀 。 b 有機(jī)溶劑：乙醇 、 丙酮 c 低溫操作 ， 邊加入邊攪拌 ， 防止局部過熱 ， 引 起變性 ， 盡量縮短處理時(shí)間 。 （ 三 ） 根據(jù)電荷不同的分離方法 1 . 電泳 原理與 AA的電泳相同 電泳：帶電顆粒在電場中移動(dòng)的現(xiàn)象。 分子大小不同 的蛋白質(zhì)所帶 凈電荷密度不同 ，遷移率不同，在電泳時(shí)可以分開。 a. 自由界面電泳：蛋白質(zhì)溶于緩沖液中進(jìn)行電泳。 b. 區(qū)帶電泳：將蛋白質(zhì)溶液點(diǎn)在浸了緩沖液的支持物上進(jìn) 行電泳，不同組分形成帶狀區(qū)域。 1）紙電泳：用濾紙作支持物。 2）凝膠電泳：用凝膠（淀粉、瓊脂糖、聚丙烯酰胺）作 支持物。 1）圓盤電泳：玻璃管中進(jìn)行的凝膠電泳。 2）平板電泳：鋪有凝膠的平板上進(jìn)行的電泳。 + — + 純化中應(yīng)用最多的是 聚丙烯酰胺凝膠電泳 和等電聚焦電泳 ，它們既可以作為蛋白質(zhì)純度檢驗(yàn)方法，也可以純化、制備蛋白質(zhì)。 PAGE垂直平板電泳示意圖 低 濃度 濃縮 膠 高 濃度 分離 膠 聚丙烯酰胺凝膠電泳具有三種物理效應(yīng)： ①濃縮效應(yīng) ②分子篩效應(yīng) ③電荷效應(yīng) 等電聚焦電泳 ：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在其等電點(diǎn)時(shí)，凈電荷為零，在電場中不再移動(dòng)。 + + － － － － + － － － － － 通電 + + － － － － + － － － － － + + － －－ － + － － － － － + + － － － － + － － － － － 1）根據(jù)蛋白質(zhì)帶電荷情況 2）不同載體： 離子交換纖維素 離子交換交聯(lián)葡聚糖：兼有分子篩效應(yīng) 離子交換交聯(lián)瓊脂糖 離子交換層析法 （ 四 ） 蛋白質(zhì)的選擇吸附分離 1 極性的硅膠和氧氣鋁以及非極性的活性碳等 具有吸附能力 2 吸咐層析法是利用物質(zhì)與不同蛋白質(zhì)的吸附能力的強(qiáng)弱不同達(dá)到分離目的 。 3 蛋白質(zhì)提純中 ， 最廣泛和最有效的是結(jié)晶磷酸鈣即羥基磷灰石 。 （ 五 ） 根據(jù)配體特異性的分離 — 親和層析 1. 是一種極為有效的分離方法 共價(jià)地結(jié)合 。 脂糖 （ 凝膠 ） 一類的載體表面 。 原子 、 原子團(tuán)和分子 ， 如：酶的作用底物 、 輔酶 、 調(diào)節(jié)效應(yīng)物及其結(jié)構(gòu)類似物 ， 激素和受體蛋白 、 抗原和抗體互為配基 。 5. 用含有自由配體的溶液洗脫蛋白質(zhì) 親合層析原理及流程示意圖 三、 蛋白質(zhì)含量分析和純度鑒定 （一） 含量的測定 1. 凱氏定氮法： 2. 雙縮脲法 — 酚試劑法： a 福林 — 酚試劑包括兩組試劑：堿性銅試劑和磷鉬酸和磷鎢酸的混合試劑 b 堿性銅試劑與蛋白質(zhì)產(chǎn)生雙縮脲反應(yīng) c 反應(yīng)后的蛋白質(zhì)的酚基在堿性條件將磷鉬酸和磷鎢酸還原為藍(lán)色的鉬藍(lán)和鎢藍(lán) ， 藍(lán)色的深淺與蛋白含量質(zhì)成正比 。 （ 二 ） 蛋白質(zhì)純度的鑒定 常用聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳法 高純度：電泳得到均一的一條區(qū)帶 低純度：電泳得到幾條區(qū)帶 本章重點(diǎn) : 、性質(zhì)、功能 、蛋白質(zhì)分離純化的基本原理與方法
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