生物化學合工大第二章蛋白質化學-資料下載頁
2025-01-16 11:52本頁面
【正文】 心 它的密度 。 ， 即停止不前 。 ， 各種蛋白質在不同密度介 質中形成獨立的區(qū)帶 。 3. 凝膠過濾 ，是根據分子大小分離蛋白質 混合物最有效的方法之一。 （商品名為 Sephadex)和瓊脂糖凝 膠（商品名為 Sepharose）。 — 用交聯劑與葡聚糖或瓊脂糖的比 例來實現 ，小分子后洗下來。 凝膠過濾法 （ 二 ） 利用溶解度差別的分離方法 1. 等電點沉淀 利用各種蛋白質在等電點時 ， 溶解度最小 這一性質 ， 可以通過調節(jié)蛋白質溶液的 PH 值 ， 將不同的蛋白質分開 。 2. 鹽溶和鹽析 鹽溶：低濃度的中性鹽在蛋白質分子表面形成雙電層 ， 使蛋白質溶解度增加； 鹽析：高濃度的中性鹽破壞蛋白質分子表面的水化層 ， 使蛋白質溶解度降低 ， 發(fā)生沉淀析出 。 分段鹽析 ：不同蛋白質鹽析所需的鹽濃度不同 ， 蛋白質溶液中 ， 逐漸增大鹽濃度 ， 不同蛋白質先后析出 ， 稱分段鹽析 。 a 有機溶劑 （ 與水相溶 ） 爭取蛋白質顆粒上的水 膜 ， 使之沉淀 。 b 有機溶劑：乙醇 、 丙酮 c 低溫操作 ， 邊加入邊攪拌 ， 防止局部過熱 ， 引 起變性 ， 盡量縮短處理時間 。 （ 三 ） 根據電荷不同的分離方法 1 . 電泳 原理與 AA的電泳相同 電泳：帶電顆粒在電場中移動的現象。 分子大小不同 的蛋白質所帶 凈電荷密度不同 ，遷移率不同，在電泳時可以分開。 a. 自由界面電泳：蛋白質溶于緩沖液中進行電泳。 b. 區(qū)帶電泳：將蛋白質溶液點在浸了緩沖液的支持物上進 行電泳，不同組分形成帶狀區(qū)域。 1）紙電泳：用濾紙作支持物。 2）凝膠電泳：用凝膠（淀粉、瓊脂糖、聚丙烯酰胺）作 支持物。 1）圓盤電泳：玻璃管中進行的凝膠電泳。 2）平板電泳：鋪有凝膠的平板上進行的電泳。 + — + 純化中應用最多的是 聚丙烯酰胺凝膠電泳 和等電聚焦電泳 ，它們既可以作為蛋白質純度檢驗方法，也可以純化、制備蛋白質。 PAGE垂直平板電泳示意圖 低 濃度 濃縮 膠 高 濃度 分離 膠 聚丙烯酰胺凝膠電泳具有三種物理效應： ①濃縮效應 ②分子篩效應 ③電荷效應 等電聚焦電泳 ：當蛋白質在其等電點時，凈電荷為零，在電場中不再移動。 + + － － － － + － － － － － 通電 + + － － － － + － － － － － + + － －－ － + － － － － － + + － － － － + － － － － － 1）根據蛋白質帶電荷情況 2）不同載體： 離子交換纖維素 離子交換交聯葡聚糖：兼有分子篩效應 離子交換交聯瓊脂糖 離子交換層析法 （ 四 ） 蛋白質的選擇吸附分離 1 極性的硅膠和氧氣鋁以及非極性的活性碳等 具有吸附能力 2 吸咐層析法是利用物質與不同蛋白質的吸附能力的強弱不同達到分離目的 。 3 蛋白質提純中 ， 最廣泛和最有效的是結晶磷酸鈣即羥基磷灰石 。 （ 五 ） 根據配體特異性的分離 — 親和層析 1. 是一種極為有效的分離方法 共價地結合 。 脂糖 （ 凝膠 ） 一類的載體表面 。 原子 、 原子團和分子 ， 如：酶的作用底物 、 輔酶 、 調節(jié)效應物及其結構類似物 ， 激素和受體蛋白 、 抗原和抗體互為配基 。 5. 用含有自由配體的溶液洗脫蛋白質 親合層析原理及流程示意圖 三、 蛋白質含量分析和純度鑒定 （一） 含量的測定 1. 凱氏定氮法： 2. 雙縮脲法 — 酚試劑法： a 福林 — 酚試劑包括兩組試劑：堿性銅試劑和磷鉬酸和磷鎢酸的混合試劑 b 堿性銅試劑與蛋白質產生雙縮脲反應 c 反應后的蛋白質的酚基在堿性條件將磷鉬酸和磷鎢酸還原為藍色的鉬藍和鎢藍 ， 藍色的深淺與蛋白含量質成正比 。 （ 二 ） 蛋白質純度的鑒定 常用聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳法 高純度：電泳得到均一的一條區(qū)帶 低純度：電泳得到幾條區(qū)帶 本章重點 : 、性質、功能 、蛋白質分離純化的基本原理與方法
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