生物化學(xué)蛋白質(zhì)環(huán)境-資料下載頁
2025-07-25 15:31本頁面
【正文】 在蛋白質(zhì)的抽提液中加入一定量的中性鹽，使蛋白質(zhì)沉淀下來，常用的中性鹽為 (NH4)2SO NH4Cl等 2）等電點(diǎn)沉淀 利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時溶解度最小這一特性，可以調(diào)溶液的 pH，盡量接近它的等電 點(diǎn)，而使蛋白質(zhì)沉淀。 3）低溫有機(jī)溶劑沉淀 常用的是乙醇、丙酮。 1）透析和超濾 超濾法：是最近幾年發(fā)展起來的一種新技術(shù)，利用分子大小不同，來分離蛋白質(zhì)。 透析： 通過小分子經(jīng)過半透膜擴(kuò)散到水（或緩沖液）的原理，將小分子與生物大分子分開的一種分離純化技術(shù)。 （ 2） 根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小進(jìn)行分離 2）凝膠過濾 ? 也稱分子排阻層析 ,分子篩層析 ,這是 根據(jù)蛋白質(zhì)分子量大小不同來分離純化蛋白質(zhì)的一種方法 ,分子量大的先下來. ? 常用的凝膠 : 葡聚糖凝膠 (Sephadex) ? 聚丙烯酰胺凝膠 (BioGEIP) ? 瓊脂糖凝膠（商品名因生產(chǎn)廠家不用） 自由電泳：沒有支持物的一類電泳 紙電泳 區(qū)帶電泳：根據(jù)支持物不同 醋酸纖維膜電泳 瓊脂糖凝膠電泳 PAGE電泳 （ 3）根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進(jìn)行分離 1）電泳 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（ SDSPAGE） SDS（十二烷基硫酸鈉）是一種陰離子去污劑，帶有很多負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)結(jié)合以后，蛋白質(zhì)分子帶有足夠的負(fù)電荷，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷，蛋白質(zhì)分子原有的電荷就變得無足輕重了，所以在電場上 移動的速度完全取決于蛋白質(zhì)分子的大小 。 SDS可將蛋白質(zhì)解離成亞基，所以測出的分子量是亞基的分子量。 2）離子交換層析 離子交換層析是根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷的不同進(jìn)行分離純化。 常用的陽離子交換劑為羧甲基纖維素（ CMC）， 陰離子交換劑為二乙氨基乙基纖維素（ DEAEC）。 親和層析 這是根據(jù)蛋白質(zhì)能與特異的配體相結(jié)合而設(shè)計的一種方法。 蛋白質(zhì) ＋ 配體 蛋白質(zhì)配體復(fù)合物 （ 4）根據(jù)配體特異性進(jìn)行分離 這種分離純化方法由于專一性強(qiáng)，理論上可以從復(fù)雜的體系中一步提取所需的物質(zhì)。 序列測定前的準(zhǔn)備工作 : 樣品的純度 :97%以上 ,可用電泳的方法檢查 肽鏈的數(shù)目 :兩條或兩條以上要拆開 一級結(jié)構(gòu)測定主要用小片段重疊的原理 : 蛋白質(zhì)分子中氨基酸序列的確定 1）肽鏈的拆開和分離 共價鍵 :最常見的是 SS鍵 ,可用巰基化合物還原 ,如巰基乙醇 ,也可用過甲酸 . 非共價鍵 :可用變性劑 8M尿素或 6M鹽酸胍或濃鹽溶液處理 序列測定的步驟 : N端分析方法 : (1)二硝基氟苯法 (DNP法或 DNFB法 ) (2)丹磺酰氯法 (DNS法 ) 這兩種方法 ,水解后 ,只有與試劑連接的 N端氨基酸沒被水解 ,其余的氨基酸殘基全部被水解下來 (3)苯異硫氰酸酯法 (PITC法 ) 水解后 ,僅靠近 PITC的 N端氨基酸斷裂下來產(chǎn)生 PITC氨基酸并環(huán)化 ,其后的氨基酸可以繼續(xù)反應(yīng)分析 ,取決于反應(yīng)試劑的純度和反應(yīng)產(chǎn)率 . (4)氨肽酶法 :專一性不夠高 ,從 N端開始每次釋放一個氨基酸殘基 . 2）末端分析 :包括 N端分析和 C端分析 N端氨基酸封閉的幾種情況 : (1)N端乙?；? (2)環(huán)肽 (3)N端的谷氨酰胺環(huán)化成焦谷氨酰胺 C端分析 : (1)硼氫化鋰還原法 羧基 → 羥基 → 混合氨基酸 +羥胺 (C端 ) (2)肼解法 :也稱聯(lián)氨法 (加入無水 NH2NH2,100℃ ) 肽鏈 → (n1)氨基酸酰肼 +C端氨基酸 (離子交換 ) (3)羧肽酶法 羧肽酶 來源 專一性 CPA 胰臟 除 Pro,Arg和 Lys以外所有 C端 AA CPB 胰臟 只水解 C端為 Arg或者 Lys的肽鍵 CPC 植物或微生物 幾乎所有氨基酸 CPY 面包酵母 幾乎所有氨基酸 3 ）肽鏈的部分水解 化學(xué)方法 : (1)溴化氰 (CNBr)裂解法 :溴化氰作用于甲硫氨酸的羧基形成的肽鍵 ,一般蛋白質(zhì)中含甲硫氨酸較少 ,此法水解后 ,可得到較大的肽段 . (2)羥胺 (NH2OH)裂解法 主要裂解 AsnGly間的肽鍵 , AsnLeu及 AsnAla也部分裂解 . 酶解法 : (1)胰蛋白酶 (Trypsin) 作用于堿性氨基酸如 ,但右邊不能是 Pro (2)胰凝乳蛋白酶 (糜蛋白酶 Chymotrypsin) 作用于芳香族氨基酸 ,如 Phe,Trp,Tyr的羧基形成的肽鍵 ,但右邊不能是 Pro (3)嗜熱菌蛋白酶 : 作用于 Ile,Met,Phe,Trp,Tyr,Val等芳香族和疏水性氨基酸的氨基形成的肽鍵 ,但右邊不能是 Pro (4)彈性蛋白酶 作用于小的中性氨基酸的羧基形成的肽鍵 ,如Ala,Gly,Ser,Val (5)胃蛋白酶 作用于 Leu,Phe,Trp的氨基形成的肽鍵 ,但左邊不能是 Pro (6)V8酶 作用于 Glu的羧基形成的肽鍵 4）肽段的分離和氨基酸序列的測定 可用離子交換層析和凝膠過濾兩種方法分離 蛋白質(zhì)序列測定儀測定氨基酸序列 5） 找重疊肽從而推斷出整個肽鏈的氨基酸序列 如 : N末端殘基 H C末端殘基 S 第一套肽段 :OUS,PS,EOVE,RLA,HOWT 第二套肽段 :SEO,WTOU,VERL,APS,HO 借助重疊肽確定肽段次序 : 末端殘基 : H S 末端肽段 : HOWT OUS APS 第一套肽段 HOWT OUS EOVE RLA PS 第二套肽段 HO WTOU SEO VERL APS 推斷全序列 HOWTOUSEOVERLAPS 6 ） 二硫鍵位置的確定 對角線電泳法 : 先用胃蛋白酶水解 ,分成小肽 ,點(diǎn)樣在濾紙中央 ,進(jìn)行第一向電泳 ,電泳完畢 ,將濾紙暴露在過甲酸蒸汽中 ,使 SS鍵斷裂 ,轉(zhuǎn) 90176。 ,進(jìn)行第二向電泳,不在對角線上的為 S所在位置
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