【正文】 量很大（ 1100nm），它在水中能夠形成膠體溶液。蛋白質(zhì)溶液具有膠體溶液的典型性質(zhì)，如丁達(dá)爾現(xiàn)象、布郎運(yùn)動等。 由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過半透膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去。 透析法：以半透膜提純蛋白質(zhì)的方法叫透析法 半透膜：只允許溶劑小分子通過，而溶質(zhì)大分子不能通過，如羊皮紙、火棉膠、玻璃紙等 布郎運(yùn)動、丁道爾現(xiàn)象、電泳現(xiàn)象，不能透過半透膜，具有吸附能力 蛋白質(zhì)溶液穩(wěn)定的原因 表面形成水膜（水化層）； 帶相同電荷。 膠體性質(zhì) 3 蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng) 定義 ： 蛋白質(zhì)在溶液中靠水膜和電荷保持其穩(wěn)定性，水膜和電荷一旦除去，蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性就被破壞，蛋白質(zhì)就會從溶液中沉淀下來，此現(xiàn)象即為蛋白質(zhì)的沉淀作用。 沉淀試劑 : 加高濃度鹽類 （鹽析）：加鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出。分段鹽析：調(diào)節(jié)鹽濃度，可使混合蛋白質(zhì)溶液中的幾種蛋白質(zhì)分段析出。血清球蛋白（ 50%(NH4)2SO4飽和度），清蛋白（飽和(NH4)2SO4)。 加重金屬鹽 加生物堿試劑 (單寧酸、苦味酸、鉬酸、鎢酸、三氯乙酸能沉淀生物堿，稱生物堿試劑 ) 4 蛋白質(zhì)的變性 定義 : 天然蛋白質(zhì)受物理或化學(xué)因素的影響，其共價(jià)鍵不變，但分子內(nèi)部原有的高度規(guī)律性的空間排列發(fā)生變化，致使其原有性質(zhì)發(fā)生部分或全部喪失，稱為蛋白質(zhì)的變性 (denaturation) 。 實(shí)質(zhì) : 次級鍵斷裂，空間結(jié)構(gòu)破壞。 (變性蛋白質(zhì)分子互相凝集為固體的現(xiàn)象稱凝固 ) 蛋白質(zhì)的變性 蛋白質(zhì)變性后的表現(xiàn) 生物活性喪失；溶解度降低，對于球狀蛋白粘度增加；生化反應(yīng)易進(jìn)行；光吸收系數(shù)增大；組分和分子量不變。 物理因素： 高溫、高壓、震蕩、紫外線、電離輻射、 超聲波等。 化學(xué)因素： 強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑 、 重金屬鹽等。 引起蛋白質(zhì)變性的主要因素 蛋白質(zhì)的復(fù)性 定義 ： 當(dāng)變性因素除去后，變性蛋白質(zhì)又可恢復(fù)到天然構(gòu)象，這一現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性（ renaturation）。 蛋白質(zhì)變性的利用 ： 醫(yī)療方面；食品方面；蛋白質(zhì)制備；酶制劑保存等。 (有些蛋白質(zhì)的變性作用是可逆的，其變性如不超過一定限度，經(jīng)適當(dāng)處理后，可重新變?yōu)樘烊坏鞍踪|(zhì) ) 反應(yīng)名稱 試 劑 顏色 反應(yīng)有關(guān)基團(tuán) 有此反應(yīng)的蛋白質(zhì)或氨基酸 雙縮脲反應(yīng) NaOH、 CuSO2 紫 色 或 粉紅色 二個(gè)以上肽鍵 所有蛋白質(zhì) 米倫反應(yīng) HgNO3 、Hg(NO3)2 及HNO3混合物 紅色 Tyr 黃色反應(yīng) 濃 HNO3及 NH3 黃色 、 橘色 Tyr、 Phe 乙醛酸反應(yīng) (HopkingCole 反應(yīng) ) 乙醛酸試劑及濃H2SO4 紫色 Trp 坂口反應(yīng) (Sakaguchi反應(yīng) ) α萘酚 、 NaClO 紅色 胍基 Arg 酚試劑反應(yīng) (FolinCioculteu反應(yīng) ) 堿性 CuSO4及磷鎢酸 鉬酸 藍(lán)色 酚基 、 吲哚基 Tyr 茚三酮反應(yīng) 茚三酮 藍(lán)色 自由氨基及羧基 α氨基酸 5 蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) — OH N 6 蛋白質(zhì)的紫外吸收 大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。 這三種氨基酸的在 280nm 附近有最大吸收。因此，大多數(shù)蛋白質(zhì)在 280nm 附近顯示強(qiáng)的吸收。 利用這個(gè)性質(zhì)，可以對蛋白質(zhì)進(jìn)行定性鑒定和定量測定。 7 蛋白質(zhì)的分離和純化 主要是利用蛋白質(zhì)之間各種特性的差異，包括蛋白質(zhì)分子的酸堿性質(zhì)、分子的大小和形狀、溶解度、吸附性質(zhì)和對配體分子的特異親合力等。 蛋白質(zhì)純化的目標(biāo) : 增加制品的純度，即設(shè)法除去變性的和不需要的蛋白質(zhì)以增加單位蛋白質(zhì)重量中所需蛋白質(zhì)的含量或生物活性。 分離純化蛋白質(zhì)的程序?yàn)椋呵疤幚恚?xì)胞或組織處理）、粗分級分離（除去雜蛋白）和細(xì)分級分離。 分子大小 透析和超過濾： 透析指利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜而與小分子分離；超濾是利用壓力或離心力使小分子溶質(zhì)通過半透膜而蛋白質(zhì)被截留在膜上而分離。 密度梯度離心： 蛋白質(zhì)顆粒在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時(shí)，質(zhì)量和密度大的顆粒比質(zhì)量和密度小的顆粒沉降得快，且每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與其自身密度相等的介質(zhì)密度梯度時(shí)，即停止不前，最后各種蛋白質(zhì)在離心管中被分離成不同的區(qū)帶。 凝膠過濾： 即分子排阻層析。凝膠顆粒內(nèi)部為多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。大分子最先流出層析柱。 等電點(diǎn)沉淀和 pH控制 鹽溶和鹽析： 中性鹽在低濃度時(shí)可增加蛋白質(zhì)的溶解度，即鹽溶。原因是蛋白質(zhì)分子吸附鹽類離子后，帶電層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，而與水分子相互作用加強(qiáng)；當(dāng)離子強(qiáng)度增大到足夠高時(shí)，此時(shí)與蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)接觸的自由水被移去以溶劑化鹽離子，導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)暴露，使蛋白質(zhì)因疏水作用凝聚沉淀。 有機(jī)溶劑分級分離法 ：一是降低介質(zhì)的介電常數(shù)，二是與蛋白質(zhì)爭奪水化水。 溫度沉淀： 溫度對溶解度有影響，低溫穩(wěn)定，高溫不穩(wěn)定。在 0~40℃ ，大部分的球狀蛋白質(zhì)溶解度隨溫度升高而增加。 溶解度 電荷 電泳 （凈電荷、分子大小、形狀） 區(qū)帶電泳 聚丙烯酰氨凝膠電泳 （ PAGE） 毛細(xì)管電泳 離子交換層析 ： 是根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷的不同進(jìn)行分離純化。常用的陽離子交換劑為羧甲基纖維素（ CMC），陰離子交換劑為二乙氨基乙基纖維素（ DEAEC）。 等電聚焦： 外加電場時(shí)，蛋白質(zhì)混合物在具有 pH梯度的介質(zhì)中移向并聚焦（停留）在等于其等電點(diǎn)的pH處，形成區(qū)帶。 層析聚焦： 層析柱中建立連續(xù)的 pH梯度，蛋白質(zhì)樣品由柱上端隨緩沖液的展開而聚焦在各自的等電點(diǎn)pH處，形成區(qū)段。 吸附： 吸附層析，吸附劑（硅石、氧化鋁、活性碳）和疏水吸附劑，與待分離分子和雜質(zhì)分子的吸附與解吸能力不同。 特異親和力： 親和層析 —— 這是根據(jù)蛋白質(zhì)能與特異的配體相結(jié)合而設(shè)計(jì)的一種方法。 其它： 如高效液相層析（ HPLC） ,快速蛋白液相層析（ FPLC） 蛋白質(zhì) ＋ 配體 蛋白質(zhì)配體復(fù)合物 附 A: 蛋白質(zhì)含量測定與純度鑒定： 測定蛋白質(zhì)含量的常用方法： 凱氏定氮法、雙縮脲法、 Folin酚試劑法（ Lowry法，標(biāo)準(zhǔn)測定方法） 、紫外吸收法、染料（考馬斯亮藍(lán)）結(jié)合法、膠體金法（帶負(fù)電的疏水膠體，洋紅色，遇蛋白質(zhì)變藍(lán)色，靈敏度最高） ? 蛋白質(zhì)純度的鑒定方法： ? 采用物理化學(xué)方法如電泳、離心沉降、 HPLC和溶解度分析等。純的蛋白質(zhì)電泳時(shí)，其電泳圖譜只呈現(xiàn)一個(gè)條帶或峰，離心時(shí)以單一的沉降速度移動；純的蛋白質(zhì)在一定的溶劑系統(tǒng)中具有恒定的溶解度，即溶解度曲線只有一個(gè)折點(diǎn)，在折點(diǎn)以前直線斜率為 1，在折點(diǎn)以后斜率為零；此外， N末端分析也用于純度鑒定（單體蛋白質(zhì)而言）。 ? ( 必須指出，采用任何單獨(dú)的一種方法鑒定純度只能作為蛋白質(zhì)均一性的必要條件而非充分條件，即蛋白質(zhì)往往在一種鑒定中表現(xiàn)為均一性，而在另一種鑒定中又表現(xiàn)為不均一性 ) 附表 B: 測定蛋白質(zhì)分子相對質(zhì)量的方法 根據(jù)化學(xué)組成測定最低相對分子質(zhì)量： 測定某一微量元素或某一氨基酸的含量如鐵原子或色氨酸，并假設(shè)蛋白質(zhì)分子中只有一個(gè)鐵原子或一個(gè)色氨酸，即最低相對分子質(zhì)量 =鐵的原子量 /鐵的百分含量 滲透壓法： 在半透膜存在時(shí)，蛋白質(zhì)溶液將產(chǎn)生滲透壓（平衡時(shí)的靜水壓力）。理想溶液的滲透壓與溶質(zhì)的濃度呈線性相關(guān)。滲透壓法簡單、準(zhǔn)確、且不受蛋白質(zhì)分子的形狀和水化程度影響，但受 pH的影響，不能區(qū)別溶液中蛋白質(zhì)分子是否均一。 沉降法： 離心力作用 沉降速率法：單位離心場的沉降速度是個(gè)定值，稱沉降系數(shù) s。 沉降平衡法：沉降產(chǎn)生濃度梯度 凝膠過濾法： 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（已知 Mr和斯托克半徑）和待測蛋白質(zhì)必須具有相同的分子形狀（接近球體），分子形狀為線型或與凝膠發(fā)生吸附的蛋白質(zhì)不可用此法測定。 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法： 加入 SDS和少量巰基乙醇，則電泳遷移率主要取決于其相對分子質(zhì)量，而與電荷和分子形狀無關(guān)。