生物化學(xué)簡(jiǎn)明教程第二章蛋白質(zhì)-閱讀頁(yè)
2025-06-22 20:45本頁(yè)面
【正文】 時(shí)無(wú)生物學(xué)活性。③亞基之間的結(jié)合力主要是疏水作用，其次是氫鍵和離子鍵。例如：血紅蛋白。，以行使更復(fù)雜的功能。，提高催化效率?！窨偨Y(jié)：蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)是它的氨基酸序列蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是由氫鍵導(dǎo)致的肽鏈卷曲與折疊蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)是多肽鏈自然形成的三維結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)是亞基的空間排列一個(gè)天然蛋白質(zhì)在一定條件下，往往只有一種或很少幾種構(gòu)象。 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)分子具有多樣的生物學(xué)功能，需要一定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，還需要一定的空間構(gòu)象。根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上的差異，可以斷定它們?cè)谟H緣關(guān)系上的遠(yuǎn)近。 ：分子病的概念：由于遺傳基因的突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的改變或某種蛋白質(zhì)缺乏引起的疾病。：又稱變構(gòu)效應(yīng)，是指寡聚蛋白與配基結(jié)合，改變蛋白質(zhì)構(gòu)象，導(dǎo)致蛋白質(zhì)生物活性改變的現(xiàn)象。蛋白質(zhì)構(gòu)象改變導(dǎo)致疾病的機(jī)理：有些蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)淀粉樣纖維沉淀的病理改變。 蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù) 蛋白質(zhì)的性質(zhì)1. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子量：在10 000~1 000 000之間。2. 蛋白質(zhì)的兩性電離及等電點(diǎn)：①蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)( isoelectric point, pI)調(diào)節(jié)溶液的pH，使蛋白質(zhì)所帶的正、負(fù)電荷相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，在電場(chǎng)中既不向陽(yáng)極移動(dòng)，也不向陰極移動(dòng)，此時(shí)溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。②變性的本質(zhì)：破壞非共價(jià)鍵和二硫鍵，不改變蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。 ④復(fù)性(renaturation)：若蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質(zhì)仍可恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能，稱為復(fù)性。⑥變性的分類(lèi)：：例如，把經(jīng)過(guò)短時(shí)間煮沸的胰蛋白酶冷卻，可以恢復(fù)天然胰蛋白酶的性質(zhì)(如結(jié)晶性、活性等)。臨床上常用高溫、紫外線、酒精等物理或化學(xué)方法使細(xì)菌或病毒的蛋白質(zhì)變性而失去致病及繁殖能力。4. 蛋白質(zhì)的凝固作用(protein coagulation)：蛋白質(zhì)變性后的絮狀物加熱可變成比較堅(jiān)固的凝塊，此凝塊不易再溶于強(qiáng)酸和強(qiáng)堿中。②布朗運(yùn)動(dòng)、丁道爾現(xiàn)象、電泳現(xiàn)象，不能透過(guò)半透膜，具有吸附能力③蛋白質(zhì)溶液穩(wěn)定的原因：表面形成水膜（水化層）；帶相同電荷。分段鹽析：調(diào)節(jié)鹽濃度，可使混合蛋白質(zhì)溶液中的幾種蛋白質(zhì)分段析出。②有機(jī)溶劑沉淀反應(yīng)：用與水互溶的乙醇、丙酮等奪取水膜, 等電點(diǎn)時(shí)加入更易沉淀, 不同蛋白質(zhì)所需溶劑濃度不同分級(jí)沉淀, 但易引起變性，與有機(jī)溶劑濃度、作用時(shí)間和沉淀溫度有關(guān)條件：低溫（0~4。苦味酸、鉬酸、鎢酸、三氯乙酸、單寧酸、能沉淀生物堿，稱生物堿試劑。(2) 在沉淀過(guò)程中，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒(méi)有發(fā)生變化，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀。◇不可逆沉淀(1)在強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水。(3)如加熱沉淀、強(qiáng)酸、堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。9. 蛋白質(zhì)的紫外吸收：由于蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長(zhǎng)處有特征性吸收峰。①鹽析(salt precipitation)是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離。2. 根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小進(jìn)行分離①透析及超濾法：(dialysis):利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開(kāi)的方法。②層析法③凝膠過(guò)濾(gel filtration)又稱分子篩層析，利用各蛋白質(zhì)分子大小不同分離。3. 根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進(jìn)行分離蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場(chǎng)中能向正極或負(fù)極移動(dòng)。根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。*等電聚焦電泳，通過(guò)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。4. 根據(jù)配體特異性進(jìn)行分離親和層析法:親和層析利用待分離物質(zhì)和它的特異性配體間具有特異的親和力，從而達(dá)到分離的目的。：(1)測(cè)定末端氨基酸數(shù)目，確定蛋白質(zhì)分子是由幾條肽鏈構(gòu)成的；(2)拆分蛋白質(zhì)分子的多肽鏈，斷開(kāi)多肽鏈內(nèi)二硫鍵并分離出每條肽鏈。：①多肽鏈的分離：如果蛋白質(zhì)含有一條以上的肽鏈，須分離純化各肽鏈。⑵還原法：幾條多肽鏈通過(guò)二硫鍵交聯(lián)在一起。⑶Cleland試劑的還原作用③分析每一條多肽鏈的氨基酸組成：經(jīng)分離、純化的多肽鏈一部分樣品進(jìn)行完全水解，測(cè)定它的氨基酸組成，并計(jì)算出氨基酸成分的分子比或各種殘基的數(shù)目。④鑒定多肽鏈N－末端殘基：方法:Sanger法（二硝基氟苯反應(yīng)），DNS法（丹磺酰氯反應(yīng)），Edman法（異硫氰酸苯脂反應(yīng)），氨肽酶法。），LiBH4還原法。Pro水解受抑。Leu，Met和His水解稍慢。），羥胺法（專一性斷裂AspGly之間的肽鍵。）●常用的斷裂多肽鏈的方法：溴化氰裂解法：專一性水解Met的羧基端；胰蛋白酶水解法：專一性水解Lys、Arg的羧基端；胰凝乳蛋白酶水；解法：專一性水解Tyr、Phe、Trp的羧基端； 胃蛋白酶水解法：專一性斷裂鍵兩端都是疏水氨基酸；金黃色葡萄球菌蛋白酶水解法：專一性水解Glu、 Asp的羧基端； 梭狀芽孢桿菌蛋白酶水解法：專一性水解Arg的羧基端。⑨確定半胱氨酸殘基間形成二硫鍵交聯(lián)橋的位置： 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的順序測(cè)定完成后，將未拆開(kāi)二硫鍵的同一種蛋白質(zhì)再一次進(jìn)行專一性的酶解，由此就可以確定完整的蛋白質(zhì)中二硫鍵的位置。將所得的肽段利用對(duì)角線電泳技術(shù)進(jìn)行分離。
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