【導(dǎo)讀】課后復(fù)習(xí)題縱觀cellbiology發(fā)展簡史，你認(rèn)為該學(xué)科近百年來快速發(fā)展的主要原因是什么？為產(chǎn)品的技術(shù)，通常稱為下游技術(shù)，也稱為下游工程或下游加工過程。很多工業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)品，包括現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)品，其質(zhì)量的優(yōu)劣、成本的高低、競爭力的大小，往往與下游技術(shù)直接相關(guān)。大多數(shù)屬于“物質(zhì)分離”范疇。由熱力學(xué)第二定律可知，混合過程是一個墑增加的過程，它是一個自發(fā)的。例如將酒精與水分開。與目的產(chǎn)物混合的雜質(zhì)包括：。異亮氨酸為％，青霉素為％，每千克產(chǎn)品中核黃素僅含幾克、胰島素僅含幾十毫克，機(jī)械沖擊點(diǎn)處溫度高達(dá)300℃左右，風(fēng)味物質(zhì)極易揮發(fā)和氧化造成損失。固液分離以除去發(fā)酵液中的不溶性固形物雜質(zhì)和菌體細(xì)胞。目的是除去與產(chǎn)物性質(zhì)差異較大的雜質(zhì)，是目的產(chǎn)物要求有較大濃縮比的過程。目的是去除與產(chǎn)物的物理化學(xué)性質(zhì)比較接近的雜質(zhì)。膜、樹脂和凝膠是目前主要的新型分離介質(zhì)。中，以期減少對人類和環(huán)境的風(fēng)險。

　　

【正文】 2．上下相的分離 (1)重力沉降 (2)離心分離（圖） 3．多聚物的分離 三、 雙水相蘋取技術(shù)的發(fā)展 雙水相萃取應(yīng)用得最多的是胞內(nèi)酶的提取。這種溫和的萃取不僅有利 于保護(hù)目的物的生物活性，而且目的蛋白得率高，純度高，但目的物還含有少量的核酸和多糖，進(jìn)一步提高目的蛋白的純度，可從雙水相體系和萃取操作方式兩方面進(jìn)行改進(jìn)。 PEG 衍生物：在 PEG 上引入親和基團(tuán)或離子基團(tuán)；采用多級萃取。 第四節(jié)、反膠團(tuán)萃取 一、概述 反膠團(tuán) (Reversed Micelles)是兩性表面活性劑在非極性有機(jī)溶劑中親水性基團(tuán)自發(fā)地向內(nèi)聚集而成的，內(nèi)含微小水滴的，空間尺度僅為納米級的集合型膠體。是一種自我組織和排列而成的，并具熱力學(xué)穩(wěn)定的有序構(gòu)造。 反膠團(tuán)的微小界面和微小水相具有兩個特 異性功能： (1)具有分子識別并允許選擇性透過的半透膜的功能； (2)在疏水性環(huán)境中具有使親水性大分子如蛋白質(zhì)等保持活性。 反膠團(tuán)萃取的優(yōu)點(diǎn)： (1)有很高的萃取率和反蘋取率并具有選擇性； (2)分離、濃縮可同時進(jìn)行，過程簡便； (3)能解決蛋白質(zhì) (如胞內(nèi)酶 )在非細(xì)胞環(huán)境中迅速失活的問題； (4)由于構(gòu)成反膠團(tuán)的表面活性劑往往具有細(xì)胞破壁功效，因而可直接從完整細(xì)胞中提取具有活性的蛋白質(zhì)和酶； (5)反膠團(tuán)萃取技術(shù)的成本低，溶劑可反復(fù)使用等。 二、反膠團(tuán) 的形成 反膠團(tuán)的構(gòu)造： 在膠體化學(xué)中我們知道，如向水溶液中加入表面活性劑，并使其濃度超過一定數(shù)值時，表面活性劑就會在水相中形成膠體或微膠團(tuán)，它是表面活性劑的聚集體。其親水性的極性端向外指向水溶液，疏水性的非極性 “尾 ”向內(nèi)相互聚集在一起。 當(dāng)向非極性溶劑中加入表面活性劑，并使其濃度超過一定數(shù)值時，也會在非極性溶劑內(nèi)形成表面活性劑的聚集體。與在水相中不同的是，其疏水性的非極性尾部向外，指向非極性溶劑，而極性頭向內(nèi)，與在水相中形成的微膠團(tuán)方向相反，因而稱之為反膠團(tuán)或 反向膠團(tuán)。 幾種可能的表面活性劑聚集體的微觀構(gòu)造。 表面活性劑的類型： 陰離子型； 陽離子型； 非離子型。 分離蛋白質(zhì)時， 使用最多的是陰離子型表面活性劑 AOT。 反膠團(tuán)的物理化學(xué)特性及制備 （ 1）．反膠團(tuán)的物理化學(xué)特性 ① 反膠團(tuán)的臨界膠團(tuán)濃度 24 ② 反膠團(tuán)含水率 W （ 2 ）．反膠團(tuán)的制備 ①注入法 ②相轉(zhuǎn)移法 ③溶解法 三、 生理活性物質(zhì)的分離農(nóng)縮 反膠團(tuán)萃取原理 蛋白質(zhì)的溶解 反膠 團(tuán)萃取 1） 氨基酸分離特性 2）酶、蛋白質(zhì)萃取特性 ①靜電性相互作用 ②立體性相互作用 ③其他的相互作用 四、 在分離工藝中的應(yīng)用 通過三步分離操作分離了核糖核酸酶 a、細(xì)胞色素 c 和溶菌酶。（圖） 使用二級混合 分離型萃取流程，用 TOMAC/%辛醇 異辛烷的溶液體系連續(xù)分離 ?淀粉酶，濃縮了 17 倍。 (圖 ) 五、 在液膜分離法中的應(yīng)用 利用含有反膠團(tuán)的有機(jī)相作為液膜，從一水相中向另一水相擇性地輸送生理活性物質(zhì)的液膜分離方法，和通常的液液 萃取法相比，具有以下一些特征： 正萃取和反萃取能同時在一個裝置內(nèi)進(jìn)行； 表面活性劑的使用量及其損失較少； 從原理上來看，速度差分離也是可能的。 圖 8—14 的形式相當(dāng)于乳化液膜型。 有研究表明，用容積 (Bulk)液膜的形式，反膠團(tuán)萃取分離蛋白質(zhì)和核酸是可能的。 第五節(jié) 浸 取 浸取：也稱之為浸出，用某種溶劑把有用物質(zhì)從固體原料中提取到溶液中的過程。 一、浸取過程的應(yīng)用 前加工： 干燥：有助于細(xì)細(xì)胞膜的破裂，溶劑也容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部直接溶解溶質(zhì)。 滾壓 ：將原料滾壓成片，使其減小到 o． 1 一 o． 5mm，則大豆及許多植物種子的細(xì)胞壁極大地破裂，植物油容易進(jìn)入溶劑。 切片：減小水溶劑從水相主體擴(kuò)散到每個細(xì)胞的距離，細(xì)胞基本上保持完好，水溶性物質(zhì)可以通過半透性細(xì)胞膜擴(kuò)散進(jìn)入水溶劑中，蛋白質(zhì)和膠體組分因透不過細(xì)胞膜而不能溶入水相。 二、浸取速率 浸取過程： (1)溶劑從溶劑主體傳遞到固體顆粒的表面； (2)溶劑擴(kuò)散滲入固體內(nèi)部和內(nèi)部微孔隙內(nèi)； (3)溶質(zhì)溶解進(jìn)入溶劑； (4)通過固體微孔隙通道中的溶液擴(kuò)散至固體表面并進(jìn)一步進(jìn)入溶劑主體 。 一般而言．第一、二兩步都很迅速，不是浸取過程總速率的控制性步驟。 溶質(zhì)通過多孔固體的擴(kuò)散可用有效擴(kuò)散系數(shù)來描 述 ，而有效擴(kuò)散系數(shù)與 Fick 定律有關(guān)。 三、浸出的其他問題 25 1．相平衡 浸取過程中的相平衡用分配系數(shù) KD 表示 KD ＝ y / x y——達(dá)到平衡時溶質(zhì)在濃相中的濃度 x——平衡時溶質(zhì)在固相中的濃度 2．溶劑的選擇 KD 大且對目的物質(zhì)的選擇性高，溶劑的價格應(yīng)低廉，無腐蝕性，無毒，閃點(diǎn)高，無爆炸性，產(chǎn)品中易去除 ,容易回收。 3．增溶作用 原先不溶或難溶性的生物大分子物質(zhì)向可溶性的、分子量較小的生物物質(zhì)轉(zhuǎn)變。 4．固體原料的頂處理： 如粉碎、干燥等。 26 授課章節(jié) 第六章 沉淀法和吸附法 學(xué)時 2 教學(xué)目標(biāo)與要求 1. 掌握沉淀法 分離生物物質(zhì)的原理和 方法 2. 掌握 吸附 法分離生物物質(zhì)的原理和方法 教學(xué)重點(diǎn)與難點(diǎn) 1. 生成鹽復(fù)合物沉淀； 。 教學(xué)方法 講授；多媒體教學(xué) 主要 教學(xué)內(nèi)容 Section 1:沉淀法 ◆ 鹽析法 ◆ 有機(jī)溶劑沉淀法 ◆ 等電點(diǎn)沉淀法 ◆ 生成鹽復(fù)合物沉淀法 Section 2: 吸附法 ◆ 吸附過程的基礎(chǔ)理論 ◆ 吸附類型 ◆ 影響吸附過程的因素 ◆ 大網(wǎng)格聚合物吸附 需掌握的專業(yè)詞匯 Cell。 Cell biology。 Cell theory 研究進(jìn)展和參考資料 韓貽仁．分子細(xì)胞生物學(xué)．第二版．北京：科學(xué)出版社， 2020 汪堃仁，薛紹白，柳惠圖．細(xì)胞生物學(xué)．第二版．北京：北京師范大學(xué)出版社， 1998 課后復(fù)習(xí)題 縱觀 cell biology 發(fā)展簡史，你認(rèn)為該學(xué)科近百年來快 速發(fā)展的主要原因是什么？ 27 第六章 沉淀法和吸附法 第一節(jié)、沉淀法 一、鹽析法； 二、有機(jī)溶劑沉淀法； 三、等電點(diǎn)沉淀法； 四、生成鹽復(fù)合物沉淀法。 第二節(jié)、吸附法 一、吸附過程的基礎(chǔ)理論 二、吸附類型 三、影響吸附過程的因素 四、大網(wǎng)格聚合物吸附 第一節(jié)、 沉 淀 法 沉淀是通過改變條件或加入某種試劑，使溶液中的溶質(zhì)由液相轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔辔龀龅倪^程。 優(yōu)點(diǎn)：成本低、設(shè)備簡單、收率高、濃縮倍數(shù)高和操作簡單。 ①鹽析法 ；多用于分離純化各種蛋白質(zhì)和酶。 ②有機(jī)溶劑沉淀法：多用于生物小分子、多糖及核酸等產(chǎn)品的分離純化，也有用于蛋白質(zhì)的沉淀。 ③等電點(diǎn)沉淀法：用于氨基酸、蛋白質(zhì)及其他兩性物質(zhì)的沉淀。 ④生成鹽復(fù)合物沉淀法：用于多種化合物，特別是小分子物質(zhì)的沉淀。 一、 鹽析法 鹽析原理 高濃度的中性鹽能破壞蛋白質(zhì)、酶等的膠體性質(zhì)，中和微粒上的電荷，促使蛋白質(zhì)等發(fā)生沉淀或絮凝現(xiàn)象。 IogS＝ 223。一 Ks?Ⅰ S—離子強(qiáng)度為Ⅰ時的蛋白質(zhì)的溶解度； Ks—鹽析 常數(shù)，與溫度和 pH 無關(guān)； 223。值 —是溶質(zhì)的特征常數(shù)，對于蛋白質(zhì)而言，其大 小主要取決于不同蛋白質(zhì)的性質(zhì)，它也與溶液的溫度和 pH 值有關(guān)，但與鹽的種類無關(guān)； 為便于計(jì)算，用鹽的摩爾數(shù) m 代替離子強(qiáng)度Ⅰ，則 IogS＝ 223。一 Ks? m 影響鹽析的主要因素 1 ） 蛋白質(zhì)濃度與鹽析的關(guān)系：高濃度蛋白質(zhì)溶液可以減少鹽的用量，但蛋白質(zhì)濃度太高，會發(fā)生嚴(yán)重的共沉作用。 2） 離子強(qiáng)度和種類的影響：離子強(qiáng)度越大，蛋白質(zhì)的溶 解度越低。不同蛋白質(zhì)鹽析所需離子強(qiáng)度不同?？捎貌煌柠}濃度將各種蛋白質(zhì)分別沉淀析出。 3 ）溫度對鹽析的影響：升溫，可增加許多無機(jī)鹽和小分子有機(jī)物的溶解度。但在高鹽濃度中，蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)的溶解度隨溫度的升高反而減小。 4 ） PH 對鹽析的影響：鹽析 pH 的選擇要以不降低產(chǎn)物的活性為原則。由于蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時最易沉淀，可選擇等電點(diǎn)的 PH 作為鹽析的 pH。 二、等電點(diǎn)沉淀法 等電點(diǎn)沉淀法： 是利用兩性電解質(zhì)在電中性時溶解度最低的原理進(jìn)行物質(zhì)分離純化的方法。 中性鹽的濃度增加時，相 應(yīng)于最低溶解度的 pH 值向偏酸方向移動；同時最底溶解度會有所增大。 28 等電點(diǎn)沉淀法應(yīng)在低離子強(qiáng)度下操作。許多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)都在偏酸性的范圍內(nèi)。 優(yōu)點(diǎn)：許多無機(jī)酸的價格低廉，并能為食品標(biāo)準(zhǔn)允許。 缺點(diǎn)：酸化時，容易引起蛋白質(zhì)失活，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)對低 PH 比較敏感。 三、有機(jī)溶劑沉淀法 有機(jī)溶劑沉淀的原理 許多水溶性有機(jī)溶劑如丙酮、乙醇、甲醉等能使溶于水的小分子生物物質(zhì)以及核酸、多糖、蛋白質(zhì)等生物大分子發(fā)生沉淀作用。其主要作用是降低水溶液的介電常數(shù)。 優(yōu)點(diǎn)：分辨能力比鹽析法高；一 ?種溶質(zhì)只在一個比 較窄的有機(jī)溶劑范圍內(nèi)沉淀；沉淀不需脫鹽；有機(jī)溶劑密度低，與沉淀物密度差大，容易進(jìn)行固液分離；有機(jī)溶劑容易蒸發(fā)，不會在成品中殘留，因此適用于食品、藥品的制備。 缺點(diǎn)：容易引起蛋白質(zhì)變性失活，有機(jī)溶劑易燃、易爆，對安全要求較高。需冷卻、降溫、低溫操作。 對同一種溶劑，蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量越大，沉淀所需有機(jī)溶劑的量越少。 影響有機(jī)溶劑沉淀的因素 有機(jī)溶劑的種類：選擇的溶劑必須能與水互溶，但與產(chǎn)物如蛋白質(zhì)等不發(fā)生反應(yīng)。 溫度：降低溫度可以增加收率。同時許多生物分子如蛋白質(zhì)、核酸等對溫度特別敏感， 溫度稍有升高，便發(fā)生變性； pH：選擇溶解度最低時的 pH，有助于提高沉淀效果。因此在接近等電點(diǎn)處，以引起沉淀所需有機(jī)溶劑的量較少。合適的 PH 也可大大提高分離的分辨能力。 樣品濃度和分子質(zhì)量：低濃度樣品需用有機(jī)溶劑的量較大，但共沉作用小，有利于提高分離的效果；但低濃度樣品損失較大，回收率低，具有生理活性的樣品容易產(chǎn)生稀釋變性。 金屬離子和離子強(qiáng)度： Mn2+、 Fe2+、 Co2+、 Zn2+等陽離子能與蛋白質(zhì)中的羧基、氨基和含有氮雜環(huán)的化合物結(jié)合，形成難溶復(fù)合物，有利于沉淀。但離子強(qiáng)度過大，不利分離。 四、生成鹽復(fù)合物沉淀 （檸檬酸鈣鹽沉淀） 工藝流程： 提取過程的化學(xué)反應(yīng)： 2C6H8O7?H2O+3CaCO3→ Ca3(C6H5O7)2?4H2O+3CO2↑ +H2O Ca3(C6H5O7)2?4H2O+3H2SO4+ 4H2O → 2C6H8O7?H2O+3CaSO4 ?2H2O 中和與酸解 中和：濾液中除含檸檬酸外，還含可溶性的殘?zhí)且约暗鞍踪|(zhì)、金屬離子等雜質(zhì)。利用 檸檬酸鈣難溶于水的特點(diǎn)，與雜質(zhì)分離的過程。 酸解：中和所得鈣鹽經(jīng)過濾、洗滌，與 硫酸反應(yīng)生成檸檬酸和硫酸鈣沉淀，過濾，濾 液含較純的檸檬酸。 生產(chǎn)設(shè)備及操作 1）調(diào)漿：調(diào)漿罐， 30—50%濃度； 2）中和：中和罐，濾液、鈣漿泵入，攪拌， 7090℃ ，控制 終點(diǎn)； 3）過濾：過濾槽、帶式過濾機(jī)， 90℃熱水逆流洗滌； 4）酸解：酸解罐，攪拌，稀酸調(diào)漿，加熱，加硫酸，控制終點(diǎn)； 5）過濾：過濾槽、帶式過濾機(jī)， 90℃熱水逆流洗滌，至 PH 大于 4。 第二節(jié)、吸附法 選擇性吸附法用于：分離精制各種產(chǎn)品、空氣的凈化、除菌、脫色、除熱源、去組胺等雜質(zhì)。 一、 吸附過程的基礎(chǔ)理論 吸附作用：物質(zhì)從流體相 (氣體或液體 )濃縮到固體表面的過程。 吸附劑：在表面上能夠發(fā)生吸附作用的固體。 吸附物：被吸附的物質(zhì)。不同固體物質(zhì)的表面自由能不同，所以對其他物質(zhì)的吸附能力不同，表面自由能越高，吸附能力越強(qiáng)。 吸附作用力也是范德華力．它是一組分子引力的總稱，包括三種力，即定向力