【導(dǎo)讀】理論課授課為40學時。本講稿按50學時編寫，講授40學時課形時，根據(jù)教學大綱取舍。生物技術(shù)在未來農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中所起的作用。以事實引起學生學習的興趣。綠色革命：20世紀50-60年代以高稈改變?yōu)榘挒闃酥镜膬?yōu)質(zhì)、高。產(chǎn)量躍上了一個新的臺階。為什么矮桿可以大幅度提高產(chǎn)量？雜種優(yōu)勢利用：70年代初，我國雜交水稻的培育成功，并大面積應(yīng)用。于生產(chǎn)，使水稻單產(chǎn)增長20%-30%，創(chuàng)造了農(nóng)業(yè)奇跡。體，生產(chǎn)人類需要的產(chǎn)品。傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中仍將發(fā)揮主導(dǎo)作用，不可用生物技術(shù)全面。植物細胞組織培養(yǎng)，劉慶昌主編，中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2020. 作物DNA標記輔助育種，方宣鈞主編，科學出版社，2020. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報；科學通報；中國科學C；植物學報；遺傳學報；接種室為密閉式，用紫外線燈進行。必須是可控的，一般是用空調(diào)或熱風機使溫度保持在25±2℃。時，應(yīng)采取措施增加濕度，以免培養(yǎng)基變干。架以放置培養(yǎng)物。高溫高壓滅菌后可能會出現(xiàn)如下問題,

　　

【正文】 啟動分裂、生長和分化常常起決定作用，而其它成分一般只起次要的輔助作用。因此，在進行花藥培養(yǎng)時，進行細致的激素方面的實驗是必要的。氮素的量和各種氮素的比例對培養(yǎng)效果有明顯影響。有機物質(zhì)在花藥培養(yǎng)中可能起重要作用。在大麥和小麥的花藥培養(yǎng)中，谷氨酰胺對小孢子胚形成具有明顯的促進作用。有些作物的花藥對培養(yǎng)基的 pH 值有一定要求。 （ 7）、培養(yǎng)條 件： 多數(shù)植物在 250C 下培養(yǎng)能誘導(dǎo)愈傷組織，可某些植物，尤其是蕓苔屬，在高溫 350C 下處理幾天，然后進入 250C 培養(yǎng)能收到最好培養(yǎng)效果。 （ 8）、活性碳的作用： (9)、培養(yǎng)密度 2． 逆境處理對小孢子胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)作用 ? 饑餓處理 ? 高溫處理 ? 低溫處理 ? γ 射線 ? 秋水仙素 44 ? 重金屬脅迫 ? 上述多因子的結(jié)合 其機理是改變細胞分裂周期，改變細胞發(fā)育途徑等 花藥培養(yǎng)操作技術(shù) 花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)單倍體的技術(shù)相對于其它細胞工程技術(shù)是一種較簡單的技術(shù)，在合適的植株上選定花蕾后，用一種適當?shù)臏缇鷦┻M行表面消毒，用無菌水沖洗 34 次，然后在無菌條件下，將花藥連同花絲一起取出，置于一個無菌的培養(yǎng)皿中，取其中一個花藥在醋酸洋紅中鏡檢，確定花粉的發(fā)育時期，若發(fā)現(xiàn)符合要求，把其余雄蕊上的花藥輕輕地從花絲上摘下，水平地放在培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。花藥培養(yǎng) 23 周后，花藥中的小孢子經(jīng)大量分裂形成胚或愈傷組織，并逐漸使花藥壁破裂，表面上看似從花藥表面形成的突出物。二周后，這類花粉粒進行細胞分裂，成為二細胞的 ―原胚 ‖，并繼續(xù)分裂形成多細胞的球形胚。隨培養(yǎng)時間的延長，球形胚逐漸發(fā)育成心形胚、魚雷形胚等。三周后，轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)，胚狀體見光有淡 黃色轉(zhuǎn)綠，并逐漸發(fā)育成小苗。 評價花藥培養(yǎng)體系的好壞需要一些技術(shù)指標體系，通常使用的有：壓片或切片觀察，計算啟動分裂的小孢子 /總小孢子或計算愈傷組織塊數(shù)（胚數(shù)、植株數(shù)） /花藥（花蕾）；或一定時間內(nèi)計算尚有活力的小孢子數(shù) /總小孢子數(shù)。 單倍體植株的加倍處理 45 單倍體植株通常情況下表現(xiàn)為植株矮小，生長瘦弱，由于染色體在減數(shù)分裂時不能正常配對，所以表現(xiàn)為高度不育。對單倍體進行加倍處理，使其成為雙單倍體，是穩(wěn)定其遺傳行為和為育種服務(wù)的必要措施。 (1) 自然加倍 (2) 秋水仙素誘導(dǎo)。 具體方法是：把幼小的花粉植株浸入過 濾滅菌的秋水仙素溶液中 96 小時，然后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基上使其進一步生長。 秋水仙素處理也可通過羊毛脂進行，即把含有秋水仙素的羊毛脂涂于上部葉片的腋芽上，然后將主莖的頂芽去掉，以刺激側(cè)芽長成二倍體的可育枝條。為了加倍顛茄的單倍體細胞， Rashid amp。 Street(1974)在懸浮培養(yǎng)基中加入 1g/L 秋水仙素，處理 24 小時之后，再把細胞轉(zhuǎn)移到不含秋水仙素的培養(yǎng)基中，結(jié)果可使 70%的細胞二倍化。 (3) 氟樂靈， 是一種植物特異性微管形成抑制劑，也可使染色體加倍 五、花粉（小孢子）培養(yǎng) 花粉培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)的比較 小孢子培養(yǎng)在某些方面比花藥培養(yǎng)有一定優(yōu)勢： ? 花藥培養(yǎng)有時會由于花藥中的有害物質(zhì)而不能誘導(dǎo)小孢子啟動第一次分裂，小孢子培養(yǎng)則不存在這一問題； ? 花粉已是單倍體細胞，誘發(fā)后經(jīng)愈傷組織或胚狀體發(fā)育成的小植株都是單倍體植株或雙單倍體，不含有因藥壁、花絲、藥隔等體細胞組織的干擾而形成的體細胞植株； ? 由于起始材料是小孢子，獲得的材料總是純合的，不管它是二倍體還 46 是三倍體； ? 小孢子培養(yǎng)可觀察到由單個細胞開始雄核發(fā)育的全過程，是一個很好的遺傳與發(fā)育研究的材料體系； ? 由于花粉能均勻地接觸化學的和物理的誘 變因素，花粉是研究吸收、轉(zhuǎn)化和誘變的理想材料。 分離花粉的方法 3. 花粉 /小孢子培養(yǎng)方法 ? 液體淺層培養(yǎng) ? 平板培養(yǎng)法 ? 看護培養(yǎng)法 ? 微室懸滴培養(yǎng)法 ? 條件培養(yǎng)法 六、禾本科植物花藥培養(yǎng)中的白化苗現(xiàn)象 禾谷類植物花粉單倍體生產(chǎn)中存在的一個嚴重問題是出現(xiàn)大量白化苗。白化苗的產(chǎn)生與很多因素有關(guān)，包括內(nèi)部因素和外部因素。在內(nèi)部因素中，基因型和花粉發(fā)育時期的影響最為明顯；外界因素中，如高溫、高 47 濃度 2， 4D、延遲轉(zhuǎn)分化培養(yǎng)時間等均可促進白化苗產(chǎn) 生。關(guān)于白化苗產(chǎn)生的機制問題一直不甚清楚，可能是由于質(zhì)體基因組的變異造成，或來自染色體畸變的花粉，也可能是花粉有絲分裂過程中，質(zhì)體不能分化并降解。 七、單倍體誘導(dǎo)中存在的問題 對于多數(shù)植物來講，能形成有活力的胚的花藥百分率很低，除此之外，還有很多問題存在： ? 通?；ㄋ幓蚧ǚ垭x體培養(yǎng)時沒有生長和發(fā)育的現(xiàn)象，或剛開始生長便導(dǎo)致胚敗育 ? 在產(chǎn)生單倍體的同時也產(chǎn)生二倍體和四倍體 ? 培養(yǎng)時我們需要小孢子分裂，而二倍體組織不分裂，但這種情況往往難以辦到 ? 白化苗難以避免，尤其是禾本科作物 ? 在混倍性的材料中很難分離出單倍體出來 ，因為單倍體細胞的生長很易被更強生長力的多倍體細胞掩蓋掉 ? 單倍體加倍并不總是能產(chǎn)生純倍體，純倍體的雙單倍體有時表現(xiàn)出后代分離 八、單倍體細胞培養(yǎng)與植物育種 我國花培育種技術(shù)走在世界前列，育成各種農(nóng)作物新品種幾十個，有的已推廣很大面積，在生產(chǎn)上發(fā)揮著重要作用。水稻花培育種最突出的成就是李梅芳等育成的 ―中花 8 號 ‖、 ―中花 9 號 ‖、 ―中花 10 號 ‖、 ―中花 11 號 ‖ 48 粳稻花培新品種，豐產(chǎn)、品質(zhì)好。其它花培水稻品種還有 ―朝花矮 ‖、 ―寧糯1 號 ‖、 ―寧糯 6 號 ‖、 ―單 209‖、 ―浙粳 66‖、 ―京花 101‖、 ―京花 103‖、 ―中花12‖、 ―花汕優(yōu) 63‖、 ―花 8504‖等品種，累計推廣面積 1360 多萬畝，社會和經(jīng)濟效益顯著。 油菜小孢子培養(yǎng)已經(jīng)成為油菜育種的重要輔助手段，由于小孢子培養(yǎng)群體大，便于選擇，可以有效地縮短育種周期。華中農(nóng)業(yè)大學利用小孢子培養(yǎng)與常規(guī)育種相結(jié)合，培育出 ―華雙 3 號 ‖雙低油菜品種，累計推廣面積達3000 萬畝。 思考題： 1．通過哪些方法可以獲得植物單倍體？單倍體一定高度不育，這種說法正確嗎？ 2．單倍體有哪些應(yīng)用價值？ 3．培養(yǎng)條件下與自然條件下的小孢子發(fā)育途徑有什么不同？ 4．什么是花粉的二型性？ 5．影響花藥培養(yǎng)的因素有哪些？小孢子培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)有什么不同？ 6．如何將單倍體細胞培養(yǎng)與育種結(jié)合培育新品種？ 7．逆境處理誘導(dǎo)小孢子胚胎發(fā)生的機制是什么？ 49 第 6 章 原生質(zhì)體培養(yǎng)與細胞雜交 教學時數(shù)： 6 學時 教學目的： 掌握原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)；原生質(zhì)體培養(yǎng)基與普通細胞培養(yǎng)基的區(qū)別；對稱融合與非對稱融合；體細胞雜種的生產(chǎn)與育種應(yīng)用。 原生質(zhì)體（ Protoplast） :指采用機械或酶解法去掉細胞壁的裸露細胞 。 一、原生質(zhì)體的應(yīng)用 由于沒有細胞壁，原生質(zhì)體為作物遺傳改良和植物學研究提供了極為有利 的試驗材料。原生質(zhì)體可以用于下面幾種研究。 ? 用作細胞雜交服務(wù)于作物改良 ? 用作遺傳轉(zhuǎn)化的對象 ? 研究細胞壁的發(fā)生過程 ? 篩選突變體 ? 膜的結(jié)構(gòu)、運輸、激素接受位點等的研究 ? 用于分離細胞器和大分子 ? 種質(zhì)資源保存 二、 原生質(zhì)體分離、純化 原生質(zhì)體分離的最基本原則是保證原生質(zhì)體不受傷害及不損害它的再生能力。 50 （一）分離方法 1 機械法分離 缺點：產(chǎn)量極低；應(yīng)用的材料受限制；操作極費力 2. 酶法分離 Cocking 最早開展這方面研究 克服了機械法分離的缺陷，可分為直接法和順序法兩種。 酶法可在短時間內(nèi)獲得大量 原生質(zhì)體，缺點是：不純的酶制劑所含雜質(zhì)對原生質(zhì)體可能有不同程度的毒害作用。 （二）影響原生質(zhì)體分離的因素（酶法） 從理論上講，只要用適當?shù)拿柑幚?，就能從任何活組織中分離得到原生質(zhì)體。但是對于原生質(zhì)體培養(yǎng)來說，要得到活性高、能進行分裂、形成愈傷組織、最后再生完整植株的原生質(zhì)體則受許多因素的影響。原生質(zhì)體分離時主要應(yīng)考慮取材、酶的種類、純度、酶液的滲透壓、酶解時間、溫度等。 1. 外植體來源 :生長旺盛、生命力強的組織和細胞是獲得高活力原生質(zhì)體的關(guān)鍵，并影響著原生質(zhì)體的復(fù)壁、分裂、愈傷組織形成乃至植株再生。用 于原生質(zhì)體分離的植物外植體有葉片、葉柄、莖尖、根、子葉、莖段、胚、愈傷組織、懸浮培養(yǎng)物（ Suspension cultures）、原球莖、花瓣和葉表皮等。 葉肉細胞是常用的材料 ,因為葉片很易獲得而且能充分供應(yīng)。取材時，一般用剛展開的幼嫩葉片。另一個分離原生質(zhì)體的常用材料是愈傷組織或懸浮細胞，采用其作材料可以避免植株生長環(huán)境的不良影響，可以常年供應(yīng)，易于控制新生細胞的年齡，處理時操作方便，無需消毒。 選用懸浮細胞作材料時，需每隔 35 天繼代一次，培養(yǎng)一段時間使細胞 51 處于旺盛生長狀態(tài)。一般在繼代后的第三天 游離原生質(zhì)體。 2. 酶液組成和濃度 ： 纖維素 ,占壁干重的 2550% 植物細胞壁由三個主要成分構(gòu)成 半纖維素 , 平均 53% 果膠質(zhì) , 5% 用來分離植物原生質(zhì)體的酶制劑主要有纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和離析酶等，酶解花粉母細胞和四分體小孢子時還要加入蝸牛酶。纖維素酶的作用是降解構(gòu)成細胞壁的纖維素，果膠酶的作用是降解連結(jié)細胞的中膠層，使細胞從組織中分開，以及細胞 與細胞分開。 常用的酶制劑及其生產(chǎn)廠家有： 纖維素酶有 Cellulase Onozuka R10 （ Kinki Yakult Manuf. Co. Ltd., Nishinomiya, 日本）， Cellulase Onozuka RS （ Kinki Yakult Manuf. Co. Ltd., Nishinomiya, 日本）， Cellulase （ Sigma）， Driselase （ Kyowa Hakko Kogyo Co. ，日本）。果膠酶有 Pectolyase Y23 （ Kikkoman Shoyu Co., Lte. Nishinomiya，日本）， Macerozyme（ Yakult Biochemicles Co.，日本）， Pectinase（ Serva）等。半纖維素酶有 Rhozyme Hp150 （ Rohm and Haas Co. inde. 美國賓西法尼亞州）。 大多數(shù)植物分離原生質(zhì)體時，纖維素酶濃度在 1%3%，果膠酶在 %1%，但也有很多例外。 3. 滲透壓： 原生質(zhì)體操作需要在一定滲透壓存在下進行，常用的配制分離 52 原生質(zhì)體酶液的溶液以及洗滌原生質(zhì)體的溶液為 CPW 液， CPW 鹽成分為： KH2PO4 KNO3 KI pH 根據(jù)滲透劑的濃度和成分可分 為以下幾種培養(yǎng)基 : CPW13M: CPW 鹽 +13%甘露醇 (mannitol) CPW9M: CPW 鹽 +9%甘露醇 CPW21S: CPW 鹽 +21%sucrose CPW0M: CPW 鹽溶液。 多數(shù)情況下，甘露醇是常用的滲透劑，可能是由于它的鈍性及擴散入原生質(zhì)體的速度很慢的緣故，這樣一來能保證一個穩(wěn)定的滲透壓。 4. 分離培養(yǎng)基 : 鈣、鎂離子很重要（？）；有時需要激素； PVP 有時能增加原生質(zhì)體產(chǎn)量。分離原生質(zhì)體的培養(yǎng)基用量一般為 10mg/g 組織。 5. 培養(yǎng)條件 :最主要的是酶處理時的溫度和 pH。不同的酶需 要的 pH 值不一樣，但 pH 大于 6 時不利于原生質(zhì)體生存。一般而言，分離原生質(zhì)體的培養(yǎng)時間與溫度成反比，可是高溫下短時間分離的原生質(zhì)體不適于培養(yǎng)，他們易發(fā)褐和破裂。但酶處理時間一般不超過 24小時。一般常用溫度是 23320C。酶處理時一般在暗處培養(yǎng)。葉片分離原生質(zhì)體可在靜置條件下進行，懸浮 53 細胞由于壁厚，培養(yǎng)（分離）過程中間斷低速震蕩有利于酶滲透。 6. 組織前處理 : 主要目的是便于原生質(zhì)體分離和促進細胞分裂 ? 高滲前處理 ? 激素處理 ? 低溫處理 ? 激素處理與低溫處理結(jié)合使用 (三 ) 原生質(zhì)體的收集、純化與活力測定 經(jīng)酶解 處理后，得到的混合物是一個由原生質(zhì)體、細胞團與細胞碎片等組成的混合液，只有將雜質(zhì)和酶液去掉，使原生質(zhì)體純化，才能進行培養(yǎng)。 1. 收集 :原生質(zhì)體混合液用濾網(wǎng) (40100181。m)去掉沒有降解的細胞及組織 ,收集濾液 . 2. 洗滌 : 將網(wǎng)下物低速離心 ,去掉上清液 ,再加無酶液的 CPW 液懸起原生質(zhì)體 ,再離心 ,棄上清 ,重復(fù)幾次即可 . :采用上浮法和下沉法兩種純化方法。上浮法是將酶解的原生質(zhì)體與