【正文】 機(jī)元素在植物生長發(fā)育中非常重要，鎂（ Mg） 是葉綠素分子的一部分，鈣（ Ca）是細(xì)胞壁的組分之一，氮（ N）是各種氨基酸、維生素、蛋白質(zhì)和核酸的重要組成部分。 （ 三）化學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)備 主要用于培養(yǎng)基的配制、分裝與滅菌，化學(xué)試劑的配制，蒸溜水的生產(chǎn)，接種材料的準(zhǔn)備、生化分析等 主要設(shè)備有：實(shí)驗(yàn)臺(tái)、水槽、涼干架、冰箱、藥品柜、電爐或微波爐、天平、攪拌器、離心機(jī)、蒸溜器、 pH 計(jì)、各種玻璃器皿（量筒、燒杯、試劑瓶、移液管、容量瓶、三角瓶、培養(yǎng)皿、 parafilm、滴管等） (四 ) 無菌操作設(shè)備 首先應(yīng)具備一個(gè)無菌操作室 ,保持清潔 ,裝 有紫外燈。 2. 太高溫度滅菌時(shí)會(huì)使糖焦化 ,可能會(huì)產(chǎn)生毒性 。培養(yǎng)架大小一般為 1200mm 600mm 400mm。2℃ 。 接種室為密閉式，用紫外線燈進(jìn)行空氣消毒。滅菌設(shè)備可以安裝在該室。 Developmental Biology。如新品種選育。 二、生物技術(shù)的產(chǎn)生與發(fā)展 ? 生物技術(shù)的概念： 生物技術(shù)（ biotechnology），有時(shí)也稱生物工程（ bioengineering），以現(xiàn)代生命科學(xué)技術(shù)成果為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)、改造生物體，生產(chǎn)人類需要的產(chǎn)品。 以事實(shí)引起學(xué)生學(xué)習(xí)的興趣。 植物生物技術(shù)講稿 張 獻(xiàn) 龍 說明 : 植物生物技術(shù)有兩個(gè)課形 : 面向植物科學(xué)技術(shù)專業(yè)的理論課授課為 50 學(xué)時(shí) , 面向其它專業(yè)的理論課授課為 40 學(xué)時(shí)。 一、植物生產(chǎn)的幾次重要革命 ? 綠色革命： 20 世紀(jì) 5060 年 代以高稈改變?yōu)榘挒闃?biāo)志的優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn) ―墨西哥小麥 ‖的矮稈化和矮稈水稻良種的全面推廣、使全世界糧食產(chǎn)量躍上了一個(gè)新的臺(tái)階 。 ? 3 基因工程 Geic engineering 細(xì)胞工程 Cell engineering 生物技術(shù) 酶工程 Enzyme engineering 發(fā)酵工程 Fermentation 蛋白質(zhì)工 程 Protein ? 生物技術(shù)的產(chǎn)生： 1953 DNA 雙螺旋的發(fā)現(xiàn)； 60 年代遺傳密碼的全部破譯； 1972 重組 DNA 技術(shù)的建立（生物技術(shù)學(xué)科產(chǎn)生的關(guān)鍵技術(shù)） 介紹重組 DNA 技術(shù)在現(xiàn)代遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、生物技術(shù)研究中的意義。 ? 生物技術(shù)與傳統(tǒng)技術(shù)結(jié)合可以加速研究進(jìn)程 ? 生物技術(shù)可以大幅度提高農(nóng)產(chǎn)品的附加值 ? 生物技術(shù)產(chǎn)品的出現(xiàn)使大批農(nóng)業(yè)公司被生物技術(shù)公司替代，使農(nóng)業(yè)經(jīng)營領(lǐng)域發(fā)生變革 5 思考題： 生物技術(shù)的概念及其涵蓋的內(nèi)容；植物生物技術(shù)包括那幾個(gè)方面；生物技術(shù)與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的關(guān)系。 TAG； Plant Breeding；Euphytica 6 第一章 植物組織培養(yǎng)的原理與方法 學(xué)時(shí)分配 ： 5 學(xué)時(shí) 教學(xué)目的 ： 通過該章教學(xué)，讓學(xué)生掌握 植物組織培養(yǎng)所涉及的基本概念；培養(yǎng)基的組成、特點(diǎn)和用途；植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)；無菌操作的原理與技術(shù)等。 培養(yǎng)基室 ： 各種藥品、母液的儲(chǔ)存，培養(yǎng)基的配制與分裝。接種室的主要儀器設(shè)備是 超凈工作臺(tái)和操作臺(tái)（用于放置培養(yǎng)基）。植物組織培養(yǎng)要求一定的光照，采用日光燈源，一般光照強(qiáng)度為 1000~4000lux。培養(yǎng)室的主要設(shè)備是培養(yǎng)架、控溫控光系統(tǒng)、搖床等。 3. 滅菌時(shí)間太長會(huì)使鹽沉淀 ,同時(shí)使瓊脂解聚 。室內(nèi)設(shè)備：放物臺(tái)、超凈工作臺(tái)、各種接種工具 （ 五）培養(yǎng)設(shè)備 自動(dòng)控溫控光系統(tǒng) 培養(yǎng)室 培養(yǎng)架 搖床 材料培養(yǎng)處 調(diào)溫培養(yǎng)箱 培養(yǎng)箱 調(diào)溫調(diào)濕培養(yǎng)箱 光照培養(yǎng)箱 10 （六）細(xì)胞學(xué)觀察設(shè)備 主要是顯微鏡系統(tǒng)，成像系統(tǒng)等。此外，鐵（ Fe）、鋅（ Zn）和鉬（ Mo）等是某些酶的組成部分。按照國際植 物生理協(xié)會(huì)的建議，植物所需要的濃度大于 ，小于 （ 2）有機(jī)營養(yǎng)成分 11 主要包括碳源（糖類）和維生素類。在其它各種維生素中，已知吡哆醇（維生素 B6），煙酸（維生素 B3），泛酸鈣（維生素 B5）和肌醇也都能顯著地改善培養(yǎng)的植物組織生長 狀況。 （ 3）植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì) 主要是細(xì)胞分裂素和生長素，有時(shí)也用 GA3。其中 IBA 和 NAA廣泛用于生根，并能與細(xì)胞分裂素互作促進(jìn)莖的增殖。培養(yǎng)基中加入細(xì)胞分裂素，主要是為促進(jìn) 細(xì)胞分裂和由愈傷組織形成器官，分化不定芽。 MS 的無機(jī)鹽和離子濃度較高，養(yǎng)分平衡，是目前使用最多的培養(yǎng)基 B5 的主要特點(diǎn)是含有較低的銨，這個(gè)成分可能對很多培養(yǎng)物的生長有抑制作用 white 的特點(diǎn)是無機(jī)鹽數(shù)量較低，適于生根培養(yǎng) KM8P 主要用于原生質(zhì)體培養(yǎng)，其特點(diǎn)是有機(jī)成分較復(fù)雜，它包括了所有的單糖和維生素，呼吸代謝中的主要有機(jī)酸。配制母液時(shí)應(yīng)注意：分別稱量；充分溶解；注意混合秩序： Ca++應(yīng)最后加入，與 SO42和 HPO42錯(cuò)開，以免產(chǎn)生沉淀；混合時(shí)要緩慢，邊攪拌邊混合。一般擴(kuò)大 200 倍，每配 1000ml 培養(yǎng)基取 5ml， EDTA 鈉鹽 需用溫水溶解，然后與 FeSO4 液混合，在 75800C 之間讓其螯合 1 小時(shí)。 2. 培養(yǎng)基的配制 – 稱出規(guī)定數(shù)量的瓊脂和蔗糖，加水直到培養(yǎng)基最終容積的 3/4，在恒溫水浴中加熱使之溶解。 – 充分混合之后，用 pH。 第三節(jié) 離體無菌操作技術(shù) 一、植物材料的消毒 15 接種前必須使材料完全無菌，這是取得植物組織培養(yǎng)成功的根本保證。為保證做到無菌操作，除實(shí)驗(yàn)中所用物品需事先消毒外，在實(shí)驗(yàn)中還要保持無菌操作。酒精燈在當(dāng)中，右手使用的物品在右側(cè)，左手用品在左側(cè)。 第四節(jié) 組織培養(yǎng)術(shù)語 ? 愈傷組織（ Callus， Calli， Calluses）：愿意指植物在受傷之后于傷口表面形成的一團(tuán)薄壁細(xì)胞，在組織培養(yǎng)中指在人工培養(yǎng)基上由外植體長出來的一團(tuán)無 序生長的薄壁細(xì)胞。 胚培養(yǎng)的概念： 植物胚胎培養(yǎng)是指使胚及具胚器官（如子房、胚珠）在離體無菌培養(yǎng)條件下發(fā)育成幼苗的技術(shù)。在這類難以成功的雜交中，雜種胚常常具有正常生長的潛力，若把雜種胚夭折以前置于某種合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，則能獲得雜種植株 。某些園藝植物如落葉樹的育種和繁育工作因種子休眠期太長而受到影響。 單倍體的產(chǎn)生方法很多，通過遠(yuǎn)緣雜交，結(jié)合胚培養(yǎng)技術(shù)是獲得單倍體的有效方法之一。從離體培養(yǎng)胚獲得的幼 20 苗只需 2~3 個(gè)月即可開花，而利用這種花作父本， 1 年內(nèi)可產(chǎn)生 2 個(gè)世代，大大地提高育種進(jìn)程。如在種子接近成熟時(shí)，把胚分離出來進(jìn)行培養(yǎng)，就能生長發(fā)育成正常植株。因這種變異類型的種子不能繁殖，故―Makapuno‖十分稀罕，價(jià)格非常昂貴，在菲律賓只有盛大宴會(huì)才供應(yīng)這種果實(shí)。這是幼胚培養(yǎng)成功的途徑。據(jù)報(bào)道，由胚培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織較其它外植體容易得到再生植株。而未成熟胚一般不能在這類簡單培養(yǎng)基上生長，它們比成熟胚對營養(yǎng)的要求更為復(fù)雜，除了無機(jī)和有機(jī)營養(yǎng)、維生素、氨基酸、激素外，胚乳的看護(hù)對于幼胚培養(yǎng)十分重要。 光照： 光對于某些植物胚胎的生長并不很重要，但對某些植物胚卻有很大影響。罌粟授粉 5 天的胚珠僅為合子胚或只有 2 個(gè)細(xì)胞的原胚 。 三、影響胚珠培養(yǎng)成功的因素 培養(yǎng)基的基本組成 （ 1）培養(yǎng)條件 激素 有機(jī)成分 （ 2）胚的發(fā)育時(shí)期 （ 3）胎座和子房 23 第三節(jié) 胚乳培養(yǎng) 一、胚乳培養(yǎng)的意義 ? 自然條件下，胚乳細(xì)胞以淀粉、蛋白質(zhì)和脂類的形式貯存著大量的營養(yǎng)物質(zhì)，以供胚胎發(fā)育和種子萌發(fā)之需。有些具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物，蘋果、香蕉，桑樹、甜菜、茶和西瓜等其三倍體已在生產(chǎn)中得到了利用，并顯示出較好的經(jīng)濟(jì)效益 ? 三倍體植株加倍可產(chǎn)生同源六倍體。 植物細(xì)胞全能性 (totipotency)： 植物體細(xì)胞或性細(xì)胞，在人為控制的培養(yǎng)條件下都具有再生成新個(gè)體的潛能，因而在適宜的條件下可以被誘導(dǎo)生長分化形成完整植株。外植體的組織塊要達(dá)到 2 萬個(gè)細(xì)胞（ 510mg）以上才容易成活；②同一植物不同部位的外植體，其細(xì)胞的分化能力、分化條件及分化類型有相當(dāng)大的差 25 別；③植物胚與幼齡組織器官比老化組織、器官更容易去分化，產(chǎn)生大量的愈傷組織；④不同物種相同部位的外植體其分化能力可能大不一樣。 或用 %升汞消毒。生長調(diào)節(jié)物質(zhì)之中，特別是生長素，對于細(xì)胞分裂的誘導(dǎo)以及在其后的生長和增殖，都是必要的物質(zhì)。這時(shí)在外觀上雖然未見明顯變化，但實(shí)際上細(xì)胞內(nèi)一些大分子代謝動(dòng)態(tài)已發(fā)生明顯的改變，細(xì)胞正積極為下一步 分裂進(jìn)行準(zhǔn)備。 形成期 。 為什么要進(jìn)行繼代培養(yǎng)？ ? 經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)一段時(shí)間后，培養(yǎng)基里的養(yǎng)分耗盡 ? 培養(yǎng)基已干燥 ? 生長物已充滿培養(yǎng)瓶 ? 培養(yǎng)物需要擴(kuò)繁 ? 瓊脂培養(yǎng)基褐化或發(fā)黑 （因?yàn)橹参锝M織在培養(yǎng)前幾周有時(shí)會(huì)產(chǎn)生毒素物質(zhì)，這些物質(zhì)會(huì)擴(kuò)散進(jìn)入培養(yǎng)基） ? 需要讓培養(yǎng)物在一種新的營養(yǎng)條件下生長 27 ? 培養(yǎng)基由于植物材料的原因使 pH 降低，導(dǎo)致培養(yǎng)基液化 一般情況下，培養(yǎng)的愈傷組織需要每 4~6 周繼代一次。 第二節(jié) 懸浮培養(yǎng) 懸浮培養(yǎng) (suspension culture)： 一般是把一些小塊生長旺盛的愈傷組織放入液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，從而使愈傷組織塊變成良好分散性的細(xì)胞和小的細(xì)胞聚集體。振蕩速度一般為 30150rpm。其方法是：培養(yǎng)瓶靜置一段時(shí)間后，用吸管吸去上清液，加入新鮮培養(yǎng)液。 器官發(fā)生： 指從愈傷組織形成芽及根的過程，芽是一個(gè)單極性結(jié)構(gòu)，物理地同母體組織聯(lián)結(jié)著。 ⑶先芽后根：愈傷組織中產(chǎn)生多個(gè)分生細(xì)胞形成分生中心，從中僅分化出芽，一般情況下待芽長到一定大小時(shí)，切下移入生根培養(yǎng)基中，在其基部 30 即可分化出根。 2. 影響器官發(fā)生的因素 ? 化學(xué)因素 : 從早期煙草組織的研究我們知道 ,器官發(fā)生的表達(dá)可被外源化學(xué)物質(zhì)控制 ,高濃度的生長素和低濃度的分裂素可以促使細(xì)胞連續(xù)繁殖 ——無組織的生長。在促進(jìn)芽的分化中， BAP是最有效的。 溫度：不同植物不一樣，需要摸索，如煙草和棉花就不一樣。產(chǎn)生胚狀體的離體培養(yǎng)物也是多種多樣的，離體的根、莖、葉、花芽、花藥、 幼苗、子葉、子房中的合子胚、胚狀體、多種單細(xì)胞、游離的小孢子以及原生質(zhì)體，都曾記錄過有直接或間接（ via callus）產(chǎn)生胚狀體的能力。胚狀體是從單細(xì)胞直接分化成小植株，而其它再生植株的方式，一般要經(jīng)過愈傷組織階段，時(shí)間上要慢得多。 ? 用于人工種子研究與生產(chǎn)，可節(jié)約大量種子，且可固定雜種優(yōu)勢。不管是那種類型的胚狀體，它都有兩個(gè)特點(diǎn)：①兩極性，即在其發(fā)生的最早階段就具有根端（胚根）和莖端（胚芽）；②它與母體植物或外植體的維管束系統(tǒng)無直接連系。但在除去細(xì)胞分裂素之后，胚狀體發(fā)生能力還可能部分地恢復(fù)。不同種的植物甚至同種植物的不同品種 (或不同地理來源 )個(gè)體之間，其個(gè)體基因型存在著差異，這就決定了不同的體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力。 4. 培養(yǎng)時(shí)間和細(xì)胞倍性變化的影響 一般由初分離或誘導(dǎo)的或僅經(jīng)過短時(shí)期培養(yǎng)的愈傷組織 ,最易產(chǎn)生胚狀體 。 七、胚胎發(fā)生的分子機(jī)制研究 主要結(jié)合自己的科研結(jié)果講述 , 讓學(xué)生掌握研究分子機(jī)制的意義、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、方法、克隆相關(guān)基因等。 ? GA 和乙烯通常抑制胚胎發(fā)生 ? 從幼嫰材料來的愈傷組織易誘導(dǎo)胚胎發(fā)生，柑桔中似乎只有珠心胚比較好 ? 降低 NH4+對于胚胎發(fā)生很重要， K+促進(jìn)胚胎發(fā)生，高濃度 Ca++抑制胚胎發(fā)生，而高濃度鹽則促進(jìn)胚胎發(fā)生 ? 光一般促進(jìn)胚胎發(fā)生 ? 高溫一般促進(jìn)胚胎發(fā)生，一些植物（尤其是花藥培養(yǎng)）需要冷激（低溫處理）才能誘導(dǎo)胚胎發(fā)生和胚的發(fā)育 ? 糖含量一般 23%為宜 ? 脫落酸在 懸浮培養(yǎng)中有利于胚胎發(fā)生 37 九、試管苗移栽 試管苗在如下幾個(gè)方面不同于田間植株： ? 試管苗的角質(zhì)層（蠟質(zhì)層）發(fā)育很差，移栽時(shí)易失水 ? 根很弱，功能差 ? 自然條件下，植物與真菌、細(xì)菌存在一種共生關(guān)系，試管苗缺乏這