【正文】 形態(tài)標(biāo)記簡(jiǎn)單直觀，在育種工作中起著重要作用。番茄的薯葉、抗 TMV的矮黃標(biāo)記、變態(tài)葉、雄性不育等外部形態(tài)性狀標(biāo)記。在園藝作物育種實(shí)踐中很早就利用形態(tài)標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，如番茄中抗 TMV的基因與矮黃性狀緊密連鎖，因此只要選矮黃的優(yōu)良單株，也就同時(shí)選得抗 TMV的番茄材料，從而提高了選擇效果。 一般通過(guò)自然突變或物理、化學(xué)誘變方法來(lái)獲得具有特定形態(tài)特征的遺傳標(biāo)記材料。形態(tài)標(biāo)記的數(shù)量在大多數(shù)作物中是有限的，而人工培育形態(tài)標(biāo)記材料所需周期長(zhǎng)，而且一些形態(tài)標(biāo)記多態(tài)性差；還有一些形態(tài)標(biāo)記對(duì)植株的表型影響太大（如矮黃、白化），并與不良性狀連鎖，難以在育種中應(yīng)用。 形態(tài)學(xué)標(biāo)記 以染色體數(shù)目變化（如單體、缺體、三體、四體）和染色體結(jié)構(gòu)變異（如缺失、易位、倒位、重復(fù)等）等特定細(xì)胞形態(tài)特征為基礎(chǔ)的細(xì)胞學(xué)標(biāo)記，在番茄等作物的基因定位、連鎖圖譜構(gòu)建、染色體操縱以及外源基因?qū)氲蔫b定中起到重要的作用，如番茄三體、單體等在基因的染色體定位研究中發(fā)揮了重要作用。但由于許多作物標(biāo)記來(lái)源困難，某些物種對(duì)染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)變異反應(yīng)敏感，染色體較小等原因限制了其在育種上大范圍應(yīng)用。 細(xì)胞學(xué)標(biāo)記 生化標(biāo)記主要是指 同工酶 與貯藏蛋白，在一定程度可以反映基因型差異。種子貯藏蛋白主要分為四類，即白蛋白，球蛋白，醇溶蛋白和谷蛋白。不同植物蛋白種類、含量不同，對(duì)種子貯藏蛋白的電泳分析已廣泛用于作物品種鑒別和種子純度鑒定。同工酶曾作為中性的遺傳標(biāo)記在植物遺傳育種方面得到了廣泛的發(fā)展與應(yīng)用。但由于蛋白質(zhì)畢竟是基因轉(zhuǎn)錄翻譯表達(dá)產(chǎn)物，且多態(tài)性位點(diǎn)較低，受植株發(fā)育階段與環(huán)境條件及溫度、電泳條件等影響，標(biāo)記的數(shù)目還相當(dāng)有限，難以滿足遺傳育種工作需要。 生化標(biāo)記 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一種基于 DNA多態(tài)性的新型遺傳標(biāo)記 ——分子標(biāo)記為作物育種性狀的選擇提供了極為重要的工具。廣義的分子標(biāo)記包括蛋白質(zhì)標(biāo)記，但分子標(biāo)記多指以 DNA為基礎(chǔ)、可遺傳的標(biāo)記。分子標(biāo)記已在作物遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、重要的性狀的標(biāo)記定位、種質(zhì)資源遺傳多樣性分析與品種指紋圖譜及純度鑒定等方面得到廣泛應(yīng)用。尤其是分子標(biāo)記輔助選擇（ molecular markerassisted selection, MAS）為育種工作提供了極大方便。 分子標(biāo)記 二、分子標(biāo)記技術(shù) 分子標(biāo)記－－－以 DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)，直接反映基因組 DNA間的差異，因而且有以下優(yōu)點(diǎn)： ①表現(xiàn)穩(wěn)定 多態(tài)性直接以 DNA形式表現(xiàn)，無(wú)組織器官、發(fā)育時(shí)期特異性，不受環(huán)境條件、基因互作影響； ②數(shù)量多 理論上遍及整個(gè)基因組； ③多態(tài)性高 自然界存在許多等位變異，無(wú)需專門(mén)人為創(chuàng)造特殊遺傳材料，這為大量重要性狀緊密連鎖的標(biāo)記篩選創(chuàng)造了條件； ④ 表現(xiàn)為 “ 中性 ” 對(duì)目標(biāo)性狀表達(dá)無(wú)不良影響，與不良性狀無(wú)必然連鎖； ⑤部分標(biāo)記遺傳方式為共顯性 可方便鑒別基因型純合與雜合類型； ⑥成本不是太高 一般實(shí)驗(yàn)室建立分子生物學(xué)基本設(shè)備即可進(jìn)行，對(duì)于特定探針或引物可引進(jìn)或根據(jù)發(fā)表的特定序列自行合成。 以 DNA為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記主要包括（ Gupata et al，1999） ◆ 基于 雜交 的分子標(biāo)記，如： RFLP（ Restriction fragment length polymorphism）。 ◆ 基于 PCR的分子標(biāo)記，如： RAPD（ Random amplified polymorphic DNA）、 AFLP（ Amplified fragment length polymorphism）、 SSR (simple sequence repeats；又稱 microsatellite )、 AFLP ( Amplicon fragment length polymorphism) 等。 ◆ 基于 DNA序列和芯片 的分子標(biāo)記，如 SNP（ single nucleotide polymorphism）。 英文縮寫(xiě) 英文名稱 中文名稱 RFLP Restriction fragment Iength polymorphism 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 STS Sequence tagged site 序列標(biāo)簽位點(diǎn) RAPD R andom amplified polymor Phic DNA 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA AFLP Amplified frangment length Polymorphism 擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性 SSR Simple sequence repeat 簡(jiǎn)單序列重復(fù) SNP Simple mucleotide polymor phism 單核苷酸多態(tài)性 主要的ＤＮＡ分子標(biāo)記 RFLP（ Restriction fragment Iength polymorphism） RFLP技術(shù)是基于 Southern雜交的分子標(biāo)記的方法。 基本原理：物種的基因組 DNA在限制性內(nèi)切酶作用下，產(chǎn)生相當(dāng)多的大小不等的片段，用放射性同位素標(biāo)記的DNA作探針，把與被標(biāo)記 DNA相關(guān)的片段檢測(cè)出來(lái)，從而構(gòu)建出多態(tài)性圖譜。 優(yōu)點(diǎn) :共顯性，非常穩(wěn)定 缺點(diǎn)：檢測(cè)步驟多，周期長(zhǎng)，費(fèi)時(shí)、費(fèi)錢(qián)； 用作探針的 DNA克隆制備、保存不方便； 放射性同位素 自從人的 RFLP圖譜構(gòu)建后，又分別構(gòu)建了果蠅、牛、大豆、小麥、水稻等多種生物的 RFLP圖譜 。 提取 DNA 酶切 DNA 凝膠電泳分開(kāi) DNA 片段 DNA 轉(zhuǎn)移到濾膜上 放射性標(biāo)記的探針顯示特 的 DNA 片段 RFLP基本步驟 圖 3 RFLP標(biāo)記 UMC89(A) 和 (B)在 F2群體中的分離 (P1為感病親本獲白， P2為抗病親本 77Ht2， R為 F2抗病單株， S為 F2感病單株， *為交換單株） ? RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) ? RAPD由 Williams 等（ 1990）和 Welsh等（ 1990）分別發(fā)展起來(lái)的分子標(biāo)記技術(shù)。這一技術(shù)是以基因組 DNA為模板，采用隨機(jī)設(shè)計(jì)的單個(gè)寡核甘酸序列（一般為 10bp）為引物，通過(guò) PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生不連續(xù)的 DNA產(chǎn)物，用于檢測(cè) DNA序列的多態(tài)性。 ? 技術(shù)簡(jiǎn)單 ,檢測(cè)速度快 。 ? RAPD分析只需少量 DNA樣品 。 ? 不依賴于種屬特異性和基因組結(jié)構(gòu) ,一套引物可用于不同生物基因組分析 。 ? 成本較低。 缺點(diǎn) : ?RAPD標(biāo)記是一個(gè)顯性標(biāo)記 ,不能鑒別雜合子和純合子 。 ?存在共遷移問(wèn)題 ,凝膠電泳只能分開(kāi)不同長(zhǎng)度DNA片段 ,而不能分開(kāi)那些長(zhǎng)度相同但堿基序列組成不同的 DNA片段 。 ?RAPD技術(shù)中影響因素很多 ,所以實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和重復(fù)性差。 與 RAPD技術(shù)類似的還有 APPCR(Arbitrary Primed PCR) 標(biāo)記和 DAF（ DNA Amplified Fingerpringts）標(biāo)記。 由于 RAPD的穩(wěn)定性較差 ,為了提高 RAPD標(biāo)記的穩(wěn)定性 ,在對(duì)基因組 DNA作 RAPD分析后 ,將目標(biāo) RAPD片段進(jìn)行克隆并對(duì)其末端測(cè)序 ,根據(jù)RAPD片段兩端序列設(shè)計(jì)特定引物 ,以此引物對(duì)基因組 DNA片段再進(jìn)行 PCR特異擴(kuò)增 ,這樣就可把與原 RAPD片段相對(duì)應(yīng)的單一位點(diǎn)鑒別出來(lái)。稱為序列特異擴(kuò)增區(qū)域 (Sequence Characterize Amplified Region, SCAR) 圖 7 RAPD引物篩選親本及抗感池的結(jié)果 ， A、 B、 C、 D分別代表獲白 、 77Ht 感病池 、 抗病池 ， M示 DNA分子量標(biāo)記 DL2022， 從左到右每組 A、 B、 C、 D分別對(duì)應(yīng)的 RAPD引物是 S2 S113 S80、S85。 ? AFLP（ Amplified frangment length Polymorphism） ? AFLP是由荷蘭 Key Gene公司 Zabeau（ 1992）發(fā)現(xiàn)，并由 Vos等（ 1995）發(fā)展起來(lái)的分子標(biāo)記技術(shù)，結(jié)合了RFLP和 RAPD技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。 ? AFLP的基本原理是基于 PCR的擴(kuò)增基因組 DNA限制性片段多態(tài)性?；蚪M DNA先用限制性內(nèi)切酶切割，然后將雙鏈接頭（ adapter）連接到 DNA片段的末端，通過(guò)選擇在 3′端分別添加 1～ 3個(gè)選擇性堿基的不同引物，選擇性地識(shí)別具有特異配對(duì)順序的酶切片段并與之結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)特異擴(kuò)增。 引物由三部分組成 :(1)與人工接頭互補(bǔ)的核心堿基序列 。(2)限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列 。(3)引物 3’端的選擇堿基序列 (1～ 10bp)。 這樣就只有那些兩端序列能與選擇堿基配對(duì)的限制性酶切片段被擴(kuò)增 ,再在高分辨力的測(cè)序膠上分開(kāi)這些擴(kuò)增產(chǎn)物。 簡(jiǎn)單重復(fù)序列 SSR (Simple Sequence Repeats, SSR)或微衛(wèi)星 （ microsatellite） 簡(jiǎn)單重復(fù)序 (SSR)也稱微衛(wèi)星 DNA,其串聯(lián)重復(fù)的核心序列為 1～ 6bp,其中最常見(jiàn)是雙核苷酸重復(fù) ,即 (CA)ｎ和 (TG)ｎ每個(gè)微衛(wèi)星 DNA的核心序列結(jié)構(gòu)相同 ,重復(fù)單位數(shù)目 10～ 60個(gè) ,其高度多態(tài)性主要來(lái)源于串聯(lián)數(shù)目的不同。 在基因組中存在重復(fù)序列： ◆ 串聯(lián)重復(fù)序列 （ tandem repeated sequence），其重復(fù)單位首尾相連，成串排列（ Flavell 1986)。 ◆ 散布重復(fù)序列 （ interspersed repeated sequence），其重復(fù)單位與其它無(wú)關(guān)序列或單拷貝序列相間排列。 SSR標(biāo)記的基本原理 : 根據(jù)微衛(wèi)星序列兩端互補(bǔ)序列設(shè)計(jì)引物 ,通過(guò) PCR反應(yīng)擴(kuò)增微衛(wèi)星片段 , 由于核心序列串聯(lián)重復(fù)數(shù)目不同 , 因而能夠用 PCR的方法擴(kuò)增出不同長(zhǎng)度的 PCR產(chǎn)物。 微衛(wèi)星長(zhǎng)度具有高度變異性，并且這種多態(tài)性常常表現(xiàn)復(fù)等位性，兩端的序列多是相對(duì)保守的單拷貝序列，因而可以根據(jù)兩端的序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，擴(kuò)增每個(gè)位點(diǎn)的微衛(wèi)星序列，從而揭示其長(zhǎng)度的多態(tài)性 （ simple sequence length polymorphism， SSLP）。 ? 一般檢測(cè)到的是一個(gè)單一的多等位基因位點(diǎn) 。 ? 微衛(wèi)星呈共顯性遺傳 ,故可鑒別雜合子和純合子 。 ? 所需 DNA量少 。 顯然 ,在采用 SSR技術(shù)分析微衛(wèi)星 DNA多態(tài)性時(shí)必須知道重復(fù)序列兩端的 DNA序列的信息 ,如不能直接從DNA數(shù)據(jù)庫(kù)查尋則首先必須對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。 優(yōu)點(diǎn)： 圖 5 SSR標(biāo)記 BNLG1152在 F2感病植株中的擴(kuò)增圖譜 （ 瓊脂糖凝膠電泳 ） （ P1為感病親本獲白 , P2為抗病親本 77Ht2， S為 F2感病單株 ，*為交換單株 ， M為分子量標(biāo)記 ） 圖 6 SSR標(biāo)記 UMC1149在 F2抗病植株中的擴(kuò)增圖譜（聚丙烯酰胺變性膠電泳）（ P1為感病親本獲白， P2為抗病親本77Ht2， R為 F2抗病單株） ISSR ISSR是一種新型的分子標(biāo)記。與 SSR相反，直接用同位素標(biāo)記 SSR序列，擴(kuò)增 2個(gè) SSR間的單拷貝序列。為了增加擴(kuò)增的特異性，在引物的 5′和 3′端分別加入 1～ 2個(gè)選擇性堿基，引物長(zhǎng)度16～ 18bp EST EST（ expressed sequence tags）是長(zhǎng)約300~400bp的基因表達(dá)序列片段。 EST技術(shù)是將mRNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA并克隆到質(zhì)?；蚴删w載體構(gòu)建成 cDNA文庫(kù)后，大規(guī)模隨機(jī)挑選 cDNA克隆，對(duì)其 5′或 3′端進(jìn)行一步法測(cè)序，所獲序列與基因數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行比較，從而獲得對(duì)生物體生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝、繁殖、衰落死亡等一系列生理生化過(guò)程認(rèn)識(shí)的技術(shù)（ Hatey 1998）。 SNP SNP是基因中的點(diǎn)突變，存在的數(shù)量多，其中有些可產(chǎn)生 RFLP，但多數(shù)突變不是發(fā)生在酶切位點(diǎn)。 人類基因組的編碼基因中有 20萬(wàn)個(gè) SNPs, 在非編碼區(qū)的數(shù)目可能還要多 10倍以上。這種標(biāo)記也只有兩種等位基因。 特性 RFLP RAPD SSR ISSR AFLP 分布 普遍存在 普遍存在 普遍存在 普遍存在 普遍存在 遺傳 共顯性 多數(shù)顯性 共顯性 多數(shù)顯性 多數(shù)顯性 多態(tài)性 中 高 高 高 非常高 等位檢測(cè) 是 不是 是 不是 不是 檢測(cè)位點(diǎn)數(shù) 1~3 1~10 1~5 0~50~更多 20~100 樣品信息量 低 ~中 高 高 高 非常高 基因組區(qū)域 底拷貝編碼 整個(gè)基因組 整個(gè)基因組 整個(gè)基