【正文】 植物生物技術講稿 張 獻 龍 說明 : 植物生物技術有兩個課形 : 面向植物科學技術專業(yè)的理論課授課為 50 學時 , 面向其它專業(yè)的理論課授課為 40 學時。本講稿按 50 學時編寫，講授 40 學時課形時，根據(jù)教學大綱取舍。 2020 年元月 2 緒論 學時分配： 1 學時 教學目的：介紹生物技術的產(chǎn)生與發(fā)展，植物生物技術與農(nóng)業(yè)革命，植物生物技術在未來農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中所起的作用。 以事實引起學生學習的興趣。 一、植物生產(chǎn)的幾次重要革命 ? 綠色革命： 20 世紀 5060 年 代以高稈改變?yōu)榘挒闃酥镜膬?yōu)質(zhì)、高產(chǎn) ―墨西哥小麥 ‖的矮稈化和矮稈水稻良種的全面推廣、使全世界糧食產(chǎn)量躍上了一個新的臺階 。為什么矮桿可以大幅度提高產(chǎn)量？（耐肥，抗倒，增加密度等） ? 雜種優(yōu)勢利用： 70 年代初，我國雜交水稻的培育成功，并大面積應用于生產(chǎn)，使水稻單產(chǎn)增長 20%30%，創(chuàng)造了農(nóng)業(yè)奇跡 。（三系、兩系、一系，資源挖掘） ? 生物技術的應用（基因革命時代的到來）： 20 世紀 80 年代初轉(zhuǎn)基因作物投入生產(chǎn)標志著生物技術在農(nóng)業(yè)上的成功應用。 二、生物技術的產(chǎn)生與發(fā)展 ? 生物技術的概念： 生物技術（ biotechnology），有時也稱生物工程（ bioengineering），以現(xiàn)代生命科學技術成果為基礎設計、改造生物體，生產(chǎn)人類需要的產(chǎn)品。 ? 3 基因工程 Geic engineering 細胞工程 Cell engineering 生物技術 酶工程 Enzyme engineering 發(fā)酵工程 Fermentation 蛋白質(zhì)工 程 Protein ? 生物技術的產(chǎn)生： 1953 DNA 雙螺旋的發(fā)現(xiàn)； 60 年代遺傳密碼的全部破譯； 1972 重組 DNA 技術的建立（生物技術學科產(chǎn)生的關鍵技術） 介紹重組 DNA 技術在現(xiàn)代遺傳學、分子生物學、生物技術研究中的意義。 三、轉(zhuǎn)基因作物在全球的應用狀況 1． 全球轉(zhuǎn)基因作物的面積分布 2． 發(fā)達國家與發(fā)展中國家的比較 3． 不同作物的應用概況 四 、植物生物技術與應用 ? 概念：植物生物技術（ Plant Biotechnology）是指對植物品質(zhì)和性狀進行改造的生物技術 。 植物生物技術包括： 4 植物組織培養(yǎng)（或細胞工程） Plant Tissue Culture 基因克隆與轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn) Gene Cloning and Geically Modified Crops （ GM crops） 分子標記及輔助育種應用 Molecular markers and MAS ? 植物生物技術發(fā)展趨勢：從 “投入特征 ”的作物向 “產(chǎn)出特征 ”的作物轉(zhuǎn)變 ? 植物生物技術的農(nóng)業(yè)應用：創(chuàng)造新材料；培育新品種；開發(fā)功能食品；快速繁殖稀有材料；材料的指紋分析、新基因挖掘、定位、輔助育 種等 五 、植物生物技術與傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)技術的關系 ? 傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)技術在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中仍將發(fā)揮主導作用，不可用生物技術全面替代。如新品種選育。 ? 生物技術與傳統(tǒng)技術結合可以加速研究進程 ? 生物技術可以大幅度提高農(nóng)產(chǎn)品的附加值 ? 生物技術產(chǎn)品的出現(xiàn)使大批農(nóng)業(yè)公司被生物技術公司替代，使農(nóng)業(yè)經(jīng)營領域發(fā)生變革 5 思考題： 生物技術的概念及其涵蓋的內(nèi)容；植物生物技術包括那幾個方面；生物技術與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的關系。 參考書： ? 植物細胞組織培養(yǎng)，劉慶昌主編，中國農(nóng)業(yè)大學出版社， 2020 ? 作物 DNA 標記輔助育種，方宣鈞主編，科學出版社， 2020 ? 植物基因工程原理與技術，王關林主編，最新版？，科學出版社 ? 農(nóng)業(yè)生物技術學報；科學通報；中國科學 C；植物學報；遺傳學報；植物生理與分子生物學學報；實驗生物學報 。 生命科學研究；科學導報 ? Trends in Biotechnology； Trends in Plant Science； Trensgenic Research； Plant Cell， Tissue and Organ Culture； Plant Science； In vitro Cellular amp。 Developmental Biology。 TAG； Plant Breeding；Euphytica 6 第一章 植物組織培養(yǎng)的原理與方法 學時分配 ： 5 學時 教學目的 ： 通過該章教學，讓學生掌握 植物組織培養(yǎng)所涉及的基本概念；培養(yǎng)基的組成、特點和用途；植物組織培養(yǎng)實驗室建設；無菌操作的原理與技術等。學習后，應能獨立設計組織培養(yǎng)實驗室，能夠進行無菌操作，能夠獨立配制培養(yǎng)基。 第一節(jié) 植物組織培養(yǎng)實驗室建設 一、植物組織培養(yǎng)實驗室的設置 標準的植物組織培養(yǎng)實驗室必須具備下列必需的設施：（ 1）清洗和貯存玻璃器皿 、塑料器皿和其它實驗器皿；（ 2）培養(yǎng)基的配制、滅菌和貯存；（ 3）植物材料的無菌操作；（ 4）可控溫度、光照、濕度的條件，以便對材料進行體外培養(yǎng)；（ 5）培養(yǎng)物生長發(fā)育過程的顯微觀察 洗滌室： 主要用于清洗各種器皿、培養(yǎng)瓶（皿）的烘干，需要與洗滌有關的各種小工具、涼干架、烘箱等。滅菌設備可以安裝在該室。 培養(yǎng)基室 ： 各種藥品、母液的儲存，培養(yǎng)基的配制與分裝。需要試劑瓶、pH 計、冰箱、天平、微波爐、水浴鍋等。 接種室 ： 用于植物材料的無菌操作。 接種室為密閉式，用紫外線燈進行空氣消毒。接種室的主要儀器設備是 超凈工作臺和操作臺（用于放置培養(yǎng)基）。 培養(yǎng)室 ： 培養(yǎng)室是存放接種有植物材料的培養(yǎng)瓶的地方。 培養(yǎng)室的溫度 7 必須是可控的，一般是用空調(diào)或熱風機使溫度保持在 25177。2℃ 。植物組織培養(yǎng)要求一定的光照，采用日光燈源，一般光照強度為 1000~4000lux。培養(yǎng)室的濕度應控制在相對濕度 80%左右，當培養(yǎng)室的相對濕度降到 50%以下時，應采取措施增加濕度，以免培養(yǎng)基變干。在培養(yǎng)室內(nèi)應設有若干培養(yǎng)架以放置培養(yǎng)物。培養(yǎng)架大小一般為 1200mm 600mm 400mm。培養(yǎng)室的主要設備是培養(yǎng)架、控溫控光系統(tǒng)、搖床等。 二、植物 組織培養(yǎng)實驗室的主要儀器設備 (一 ) 洗滌設備 一般應有一個洗滌室 ,專供洗滌及洗凈培養(yǎng)瓶的儲藏 . (二 ) 滅菌設備 高溫高壓滅菌 物理滅菌 干熱滅菌 射線照射滅菌 過濾滅菌 熏蒸滅菌 化學滅菌 消毒液滅菌 (1) 高溫高壓滅菌 原理 : 將待滅菌的物品放在一個密封的高壓高溫滅菌鍋內(nèi)，在 1210C 高 8 壓和每平方厘米 1 個大氣壓下，一般持續(xù) 15~20’，就可殺死一切微生物的營養(yǎng)體及其 孢子，適于器皿、工具、衣物和培養(yǎng)基滅菌。 滅菌操作： 滅菌需要的時間與物品有關： 含有 2050ml 培養(yǎng)基的試管或三角瓶， 1210C， 20’ 含有 50500ml 培養(yǎng)基的三角瓶， 1210C， 25’ 含有 5005000ml 培養(yǎng)基的三角瓶， 1210C， 35’ 空試管、瓶、濾紙等， 1210C， 30’ 高溫高壓滅菌后可能會出現(xiàn)如下問題 ,需要引起注意 : 1. pH 值下降 單位 。 2. 太高溫度滅菌時會使糖焦化 ,可能會產(chǎn)生毒性 。 3. 滅菌時間太長會使鹽沉淀 ,同時使瓊脂解聚 。 4. 揮發(fā)性物質(zhì)不能高溫滅菌 ,否則會被破壞 . （ 2）過濾滅菌法 原理： 將帶菌的液體或氣體通過孔徑小于 微孔濾器裝置 ,使液、氣體通過濾膜流入無孔瓶中。此法主要用于不能利用高溫高壓滅菌的培養(yǎng)基成分 滅菌操作： 不能高溫高壓滅菌 的物質(zhì) ： 多糖 Saccharose； Colchicine； Zeatin； GA（ 95%失活）； VB VB1 9 Vc、泛酸； Antibiotics； Plant extracts； Enzymes （ 3）化學滅菌法 主要用于植物材料的消毒，所用濃度、消毒時間因不同材料而定，應靈活運用并不斷總結經(jīng)驗。 （ 三）化學實驗設備 主要用于培養(yǎng)基的配制、分裝與滅菌，化學試劑的配制，蒸溜水的生產(chǎn)，接種材料的準備、生化分析等 主要設備有：實驗臺、水槽、涼干架、冰箱、藥品柜、電爐或微波爐、天平、攪拌器、離心機、蒸溜器、 pH 計、各種玻璃器皿（量筒、燒杯、試劑瓶、移液管、容量瓶、三角瓶、培養(yǎng)皿、 parafilm、滴管等） (四 ) 無菌操作設備 首先應具備一個無菌操作室 ,保持清潔 ,裝 有紫外燈。室內(nèi)設備：放物臺、超凈工作臺、各種接種工具 （ 五）培養(yǎng)設備 自動控溫控光系統(tǒng) 培養(yǎng)室 培養(yǎng)架 搖床 材料培養(yǎng)處 調(diào)溫培養(yǎng)箱 培養(yǎng)箱 調(diào)溫調(diào)濕培養(yǎng)箱 光照培養(yǎng)箱 10 （六）細胞學觀察設備 主要是顯微鏡系統(tǒng)，成像系統(tǒng)等。 包括倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、研究顯微鏡、體視顯微鏡、 CCD、計算機等。 第二節(jié) 培養(yǎng)基的配制 培養(yǎng)基：含有各種被培養(yǎng)生物材料生長所需要的營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基質(zhì)。 一、培養(yǎng)基的成分 培養(yǎng)基中包括植物生長必需的 15 種營養(yǎng)元素和某些生理活性物質(zhì)，可概括為三大類： （ 1）無機營養(yǎng)物 無機元素在植物生長發(fā)育中非常重要，鎂（ Mg） 是葉綠素分子的一部分，鈣（ Ca）是細胞壁的組分之一，氮（ N）是各種氨基酸、維生素、蛋白質(zhì)和核酸的重要組成部分。此外，鐵（ Fe）、鋅（ Zn）和鉬（ Mo）等是某些酶的組成部分。植物除了碳（ C）、氫（ H）和氧（ O）外，已知還有 12種元素對于植物的生長是必需的，它們是氮 (N)、磷（ P）、硫（ S）、鈣 (Ca)、鉀（ K）、鎂 (Mg)、鐵 (Fe)、錳（ Mn）、銅（ Cu）、鋅、硼（ B）和鋁（ Al）。其中前 6 種元素需要的數(shù)量較大，因此稱之為大量元素或主要元素。后 6種元素需要的數(shù)量較小，因此稱為微量元素或次要元素。按照國際植 物生理協(xié)會的建議，植物所需要的濃度大于 ，小于 （ 2）有機營養(yǎng)成分 11 主要包括碳源（糖類）和維生素類。 雖然大多數(shù)培養(yǎng)物都能合成所有必需的維生素，但合成能力有限，其數(shù)量顯然不足。為了能使組織很好地生長，在培養(yǎng)基中常常必須補加幾種維生素和氨基酸。其中硫胺素（維生素 B1）一般認為是一種必需的成分。在其它各種維生素中，已知吡哆醇（維生素 B6），煙酸（維生素 B3），泛酸鈣（維生素 B5）和肌醇也都能顯著地改善培養(yǎng)的植物組織生長 狀況。為了促進某些愈傷組織和器官的生長，有時還使用很多種化學成分不明的復雜的營養(yǎng)混合物，如水解酪蛋白，椰子汁，玉米胚乳，麥芽浸出物，番茄汁和酵母浸出物等。 最常用的碳源是蔗糖，使用濃度為 2%~5%。碳源除了作為植物生長發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)以外，另一重要的功能是調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的滲透壓 。 （ 3）植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì) 主要是細胞分裂素和生長素，有時也用 GA3。 生長素： 生長素影響到植物莖和節(jié)間的伸長、向性、頂端優(yōu)勢、葉片脫落和生根等現(xiàn)象。在離體植物組織培養(yǎng)中，生長素被用于誘導細胞分裂和根的分 化。在植物組織培養(yǎng)中常用的生