【正文】 m)去掉沒(méi)有降解的細(xì)胞及組織 ,收集濾液 . 2. 洗滌 : 將網(wǎng)下物低速離心 ,去掉上清液 ,再加無(wú)酶液的 CPW 液懸起原生質(zhì)體 ,再離心 ,棄上清 ,重復(fù)幾次即可 . :采用上浮法和下沉法兩種純化方法。 6. 組織前處理 : 主要目的是便于原生質(zhì)體分離和促進(jìn)細(xì)胞分裂 ? 高滲前處理 ? 激素處理 ? 低溫處理 ? 激素處理與低溫處理結(jié)合使用 (三 ) 原生質(zhì)體的收集、純化與活力測(cè)定 經(jīng)酶解 處理后，得到的混合物是一個(gè)由原生質(zhì)體、細(xì)胞團(tuán)與細(xì)胞碎片等組成的混合液，只有將雜質(zhì)和酶液去掉，使原生質(zhì)體純化，才能進(jìn)行培養(yǎng)。酶處理時(shí)一般在暗處培養(yǎng)。但酶處理時(shí)間一般不超過(guò) 24小時(shí)。不同的酶需 要的 pH 值不一樣，但 pH 大于 6 時(shí)不利于原生質(zhì)體生存。分離原生質(zhì)體的培養(yǎng)基用量一般為 10mg/g 組織。 多數(shù)情況下，甘露醇是常用的滲透劑，可能是由于它的鈍性及擴(kuò)散入原生質(zhì)體的速度很慢的緣故，這樣一來(lái)能保證一個(gè)穩(wěn)定的滲透壓。 大多數(shù)植物分離原生質(zhì)體時(shí)，纖維素酶濃度在 1%3%，果膠酶在 %1%，但也有很多例外。果膠酶有 Pectolyase Y23 （ Kikkoman Shoyu Co., Lte. Nishinomiya，日本）， Macerozyme（ Yakult Biochemicles Co.，日本）， Pectinase（ Serva）等。纖維素酶的作用是降解構(gòu)成細(xì)胞壁的纖維素，果膠酶的作用是降解連結(jié)細(xì)胞的中膠層，使細(xì)胞從組織中分開(kāi)，以及細(xì)胞 與細(xì)胞分開(kāi)。一般在繼代后的第三天 游離原生質(zhì)體。另一個(gè)分離原生質(zhì)體的常用材料是愈傷組織或懸浮細(xì)胞，采用其作材料可以避免植株生長(zhǎng)環(huán)境的不良影響，可以常年供應(yīng)，易于控制新生細(xì)胞的年齡，處理時(shí)操作方便，無(wú)需消毒。 葉肉細(xì)胞是常用的材料 ,因?yàn)槿~片很易獲得而且能充分供應(yīng)。 1. 外植體來(lái)源 :生長(zhǎng)旺盛、生命力強(qiáng)的組織和細(xì)胞是獲得高活力原生質(zhì)體的關(guān)鍵，并影響著原生質(zhì)體的復(fù)壁、分裂、愈傷組織形成乃至植株再生。但是對(duì)于原生質(zhì)體培養(yǎng)來(lái)說(shuō)，要得到活性高、能進(jìn)行分裂、形成愈傷組織、最后再生完整植株的原生質(zhì)體則受許多因素的影響。 酶法可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量 原生質(zhì)體，缺點(diǎn)是：不純的酶制劑所含雜質(zhì)對(duì)原生質(zhì)體可能有不同程度的毒害作用。 ? 用作細(xì)胞雜交服務(wù)于作物改良 ? 用作遺傳轉(zhuǎn)化的對(duì)象 ? 研究細(xì)胞壁的發(fā)生過(guò)程 ? 篩選突變體 ? 膜的結(jié)構(gòu)、運(yùn)輸、激素接受位點(diǎn)等的研究 ? 用于分離細(xì)胞器和大分子 ? 種質(zhì)資源保存 二、 原生質(zhì)體分離、純化 原生質(zhì)體分離的最基本原則是保證原生質(zhì)體不受傷害及不損害它的再生能力。 一、原生質(zhì)體的應(yīng)用 由于沒(méi)有細(xì)胞壁，原生質(zhì)體為作物遺傳改良和植物學(xué)研究提供了極為有利 的試驗(yàn)材料。 思考題： 1．通過(guò)哪些方法可以獲得植物單倍體？單倍體一定高度不育，這種說(shuō)法正確嗎？ 2．單倍體有哪些應(yīng)用價(jià)值？ 3．培養(yǎng)條件下與自然條件下的小孢子發(fā)育途徑有什么不同？ 4．什么是花粉的二型性？ 5．影響花藥培養(yǎng)的因素有哪些？小孢子培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)有什么不同？ 6．如何將單倍體細(xì)胞培養(yǎng)與育種結(jié)合培育新品種？ 7．逆境處理誘導(dǎo)小孢子胚胎發(fā)生的機(jī)制是什么？ 49 第 6 章 原生質(zhì)體培養(yǎng)與細(xì)胞雜交 教學(xué)時(shí)數(shù)： 6 學(xué)時(shí) 教學(xué)目的： 掌握原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)；原生質(zhì)體培養(yǎng)基與普通細(xì)胞培養(yǎng)基的區(qū)別；對(duì)稱融合與非對(duì)稱融合；體細(xì)胞雜種的生產(chǎn)與育種應(yīng)用。 油菜小孢子培養(yǎng)已經(jīng)成為油菜育種的重要輔助手段，由于小孢子培養(yǎng)群體大，便于選擇，可以有效地縮短育種周期。水稻花培育種最突出的成就是李梅芳等育成的 ―中花 8 號(hào) ‖、 ―中花 9 號(hào) ‖、 ―中花 10 號(hào) ‖、 ―中花 11 號(hào) ‖ 48 粳稻花培新品種，豐產(chǎn)、品質(zhì)好。關(guān)于白化苗產(chǎn)生的機(jī)制問(wèn)題一直不甚清楚，可能是由于質(zhì)體基因組的變異造成，或來(lái)自染色體畸變的花粉，也可能是花粉有絲分裂過(guò)程中，質(zhì)體不能分化并降解。白化苗的產(chǎn)生與很多因素有關(guān)，包括內(nèi)部因素和外部因素。 (3) 氟樂(lè)靈， 是一種植物特異性微管形成抑制劑，也可使染色體加倍 五、花粉（小孢子）培養(yǎng) 花粉培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)的比較 小孢子培養(yǎng)在某些方面比花藥培養(yǎng)有一定優(yōu)勢(shì)： ? 花藥培養(yǎng)有時(shí)會(huì)由于花藥中的有害物質(zhì)而不能誘導(dǎo)小孢子啟動(dòng)第一次分裂，小孢子培養(yǎng)則不存在這一問(wèn)題； ? 花粉已是單倍體細(xì)胞，誘發(fā)后經(jīng)愈傷組織或胚狀體發(fā)育成的小植株都是單倍體植株或雙單倍體，不含有因藥壁、花絲、藥隔等體細(xì)胞組織的干擾而形成的體細(xì)胞植株； ? 由于起始材料是小孢子，獲得的材料總是純合的，不管它是二倍體還 46 是三倍體； ? 小孢子培養(yǎng)可觀察到由單個(gè)細(xì)胞開(kāi)始雄核發(fā)育的全過(guò)程，是一個(gè)很好的遺傳與發(fā)育研究的材料體系； ? 由于花粉能均勻地接觸化學(xué)的和物理的誘 變因素，花粉是研究吸收、轉(zhuǎn)化和誘變的理想材料。為了加倍顛茄的單倍體細(xì)胞， Rashid amp。 具體方法是：把幼小的花粉植株浸入過(guò) 濾滅菌的秋水仙素溶液中 96 小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基上使其進(jìn)一步生長(zhǎng)。對(duì)單倍體進(jìn)行加倍處理，使其成為雙單倍體，是穩(wěn)定其遺傳行為和為育種服務(wù)的必要措施。 評(píng)價(jià)花藥培養(yǎng)體系的好壞需要一些技術(shù)指標(biāo)體系，通常使用的有：壓片或切片觀察，計(jì)算啟動(dòng)分裂的小孢子 /總小孢子或計(jì)算愈傷組織塊數(shù)（胚數(shù)、植株數(shù)） /花藥（花蕾）；或一定時(shí)間內(nèi)計(jì)算尚有活力的小孢子數(shù) /總小孢子數(shù)。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，球形胚逐漸發(fā)育成心形胚、魚雷形胚等?；ㄋ幣囵B(yǎng) 23 周后，花藥中的小孢子經(jīng)大量分裂形成胚或愈傷組織，并逐漸使花藥壁破裂，表面上看似從花藥表面形成的突出物。 （ 7）、培養(yǎng)條 件： 多數(shù)植物在 250C 下培養(yǎng)能誘導(dǎo)愈傷組織，可某些植物，尤其是蕓苔屬，在高溫 350C 下處理幾天，然后進(jìn)入 250C 培養(yǎng)能收到最好培養(yǎng)效果。在大麥和小麥的花藥培養(yǎng)中，谷氨酰胺對(duì)小孢子胚形成具有明顯的促進(jìn)作用。氮素的量和各種氮素的比例對(duì)培養(yǎng)效果有明顯影響。培養(yǎng)基中激素的種類、使用量和配比，對(duì)誘發(fā)小孢子啟動(dòng)分裂、生長(zhǎng)和分化常常起決定作用，而其它成分一般只起次要的輔助作用。 （ 5）、供體植株的基因型： 研究表明，小孢子能否進(jìn)行胚胎發(fā)生受基因控 43 制，所以，供體植株的基因型對(duì)花藥培養(yǎng)效果有重要影響。 除溫度處理以外，其它一些因素的預(yù)處理有時(shí)也能收效，如用激素處理供體植株可以提高土豆花藥單倍體的形成能力。 （ 4）、 花蕾和花藥的預(yù)處理： 對(duì)于有些物種，培養(yǎng)前對(duì)花藥和花蕾進(jìn)行預(yù)處理，能顯著提高培養(yǎng)效果。 花粉二型性的概念 ： 在花藥 /花粉培養(yǎng)時(shí)，由于對(duì)培養(yǎng)條件的反應(yīng)不同，花粉在形態(tài)上形成兩種類型，一類是具胚性的，在煙草和大麥中，花粉小，染色淺；另一類為花粉大，染色深，朝成熟花粉方向發(fā)展?；ㄋ幵诮臃N以前，一般需先用醋酸洋紅壓片法進(jìn)行鏡檢，以確定花粉的發(fā)育時(shí)期，并找出花粉發(fā)育時(shí)期與花蕾或幼穗大小、顏色等特征之間的相應(yīng)關(guān)系。 （ 3）、花粉發(fā)育時(shí)期： 因 物種而異。對(duì)煙草植株進(jìn)行氮饑餓處理可以提高花藥培養(yǎng)效果。而大麥，低溫（ 120C）和高光強(qiáng)（ 20200lux）較好。 二、單倍體的應(yīng)用價(jià)值 ? 在植物育種中使后代迅速純合 ? 提高選擇效率 ? 排除雜種優(yōu)勢(shì)對(duì)后代選擇的干擾 41 ? 遺傳研究的良好實(shí)驗(yàn)材料體系 ? 突變體的篩選 ? 消除致死基因 ? 選育新型自交系 ? 遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料 三、培養(yǎng)條件下的小孢子發(fā)育 1． 小孢子的正常發(fā)育 雄蕊的花藥中可分化出孢原組織，再進(jìn)一步分化為小孢子母細(xì)胞（通常稱花粉母細(xì)胞，染色體數(shù)為 2n），經(jīng)減數(shù)分裂形成四分孢子（染色體數(shù)為n），然后經(jīng)單核早期、單核靠邊期、雙核期（一個(gè)營(yíng)養(yǎng)核和一個(gè)生殖核），最后到達(dá)三核期而成為成熟花粉 2． 培養(yǎng)條件下的小孢子發(fā)育 培養(yǎng)條件下，由于改變了花粉原來(lái)的生活環(huán)境，花粉的正常發(fā)育途徑受到抑制，花粉第二次分裂不再象正?；ǚ郯l(fā)育那樣由生殖核再分裂一次形成兩個(gè)精子核，而是象胚細(xì)胞一樣持續(xù)分裂增殖。 2．單倍體的遺傳行為 一倍的單倍體只有一個(gè)染色體基數(shù)（ X），減數(shù)分裂時(shí)染色體不能配對(duì)，分離極不正常，但具有一定同源關(guān)系的染色體可以部分配對(duì)，從而可以對(duì)染色體的演化過(guò)程進(jìn)行研究。通過(guò)篩選可以提高雙生苗的頻率。 有些植物可產(chǎn)生多胚種子，即兩個(gè)或多個(gè)胚被共同的種皮包裹著，這些種子可產(chǎn)生單倍體 單倍體、二倍體 二倍體和單倍體 二倍體植株。這方面的例子可在煙草、小麥、金魚草中發(fā)現(xiàn)。 ② 物理照射和化學(xué)誘變。 40 這一技術(shù)在土豆育種中得到應(yīng)用。 一、單倍體的起源和遺傳行為 1．誘發(fā)植物單倍體的方法 ① 種間和屬間雜交。由 于 物種 的倍 性不 同， 可以 把單 倍 體分 成兩 類， 即 一 倍 單倍 體（ monohaploids ）， 這 類 單 倍 體 起 源 于 二 倍 體 物 種 ； 多 倍 單 倍 體（ polyhaploids），這類單倍體起源于多倍體（如 4X， 6X 等）。 引言 單倍體細(xì)胞培養(yǎng)主要包括三個(gè)方面：花藥培養(yǎng)、小孢子培養(yǎng)和未受精子房及卵細(xì)胞培養(yǎng)，其中花藥和小孢子培養(yǎng)是體外誘導(dǎo)單倍體的主要途徑。分 3 個(gè)部分有 3 個(gè)學(xué)生講述，每個(gè)學(xué)生必須演講 30 分鐘，每個(gè)學(xué)生承擔(dān)一部分：體細(xì)胞無(wú)性系變異的概念及其產(chǎn)生的遺傳基礎(chǔ)；無(wú)性系變異發(fā)生的普遍性； 無(wú)性系變異的育種應(yīng)用。 本章讓學(xué)生自己準(zhǔn)備教學(xué)資料，有學(xué)生上課，學(xué)生提問(wèn)，教師點(diǎn)評(píng)，鍛煉學(xué)生組織課堂的能力、演講能力，體會(huì)講課的感覺(jué)。 ? GA 和乙烯通常抑制胚胎發(fā)生 ? 從幼嫰材料來(lái)的愈傷組織易誘導(dǎo)胚胎發(fā)生，柑桔中似乎只有珠心胚比較好 ? 降低 NH4+對(duì)于胚胎發(fā)生很重要， K+促進(jìn)胚胎發(fā)生，高濃度 Ca++抑制胚胎發(fā)生，而高濃度鹽則促進(jìn)胚胎發(fā)生 ? 光一般促進(jìn)胚胎發(fā)生 ? 高溫一般促進(jìn)胚胎發(fā)生，一些植物（尤其是花藥培養(yǎng)）需要冷激（低溫處理）才能誘導(dǎo)胚胎發(fā)生和胚的發(fā)育 ? 糖含量一般 23%為宜 ? 脫落酸在 懸浮培養(yǎng)中有利于胚胎發(fā)生 37 九、試管苗移栽 試管苗在如下幾個(gè)方面不同于田間植株： ? 試管苗的角質(zhì)層（蠟質(zhì)層）發(fā)育很差，移栽時(shí)易失水 ? 根很弱，功能差 ? 自然條件下，植物與真菌、細(xì)菌存在一種共生關(guān)系，試管苗缺乏這種關(guān)系。 2， 4D 對(duì)胚胎發(fā)生很重要，尤其對(duì)禾本科作物。 七、胚胎發(fā)生的分子機(jī)制研究 主要結(jié)合自己的科研結(jié)果講述 , 讓學(xué)生掌握研究分子機(jī)制的意義、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、方法、克隆相關(guān)基因等。培養(yǎng)細(xì)胞倍 36 性的變化可能對(duì)胚狀體的形成有一定影響。 4. 培養(yǎng)時(shí)間和細(xì)胞倍性變化的影響 一般由初分離或誘導(dǎo)的或僅經(jīng)過(guò)短時(shí)期培養(yǎng)的愈傷組織 ,最易產(chǎn)生胚狀體 。 3. 外植體的年齡 (生理狀態(tài) )與來(lái)源 少數(shù)植物如胡蘿卜 ,幾乎所有的器官都可誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體 ,但大多數(shù)植物 ,在目前只有一定發(fā)育時(shí)期的某些器官可產(chǎn)生 胚狀體。不同種的植物甚至同種植物的不同品種 (或不同地理來(lái)源 )個(gè)體之間，其個(gè)體基因型存在著差異，這就決定了不同的體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力。 （ 4）其它激素 一般 ABA、 GA 抑制胚狀體發(fā)育，但有人認(rèn)為， ABA 對(duì)柑桔的胚狀 35 體發(fā)生有明顯的促進(jìn)作用。但在除去細(xì)胞分裂素之后，胚狀體發(fā)生能力還可能部分地恢復(fù)。 其它生長(zhǎng)素如 IAA、 NAA、 NOA、 2， 4， 5T 等的作用與 2， 4D 大致相同，但誘導(dǎo)的效果和對(duì)胚狀體形成的抑制作用不完全一致。不管是那種類型的胚狀體，它都有兩個(gè)特點(diǎn)：①兩極性，即在其發(fā)生的最早階段就具有根端（胚根）和莖端（胚芽）；②它與母體植物或外植體的維管束系統(tǒng)無(wú)直接連系。這個(gè)定義包括下列幾點(diǎn)含義：① 胚狀體是組織培養(yǎng)的產(chǎn)物，只限于組織培養(yǎng)范圍使用，區(qū)別于無(wú)融合生殖的胚；② 胚狀體起源于非合子細(xì)胞，區(qū)別于合子胚；③ 胚狀體的形成經(jīng)歷胚胎發(fā)育的過(guò)程，區(qū)別于組織培養(yǎng)中分化的芽體。 ? 用于人工種子研究與生產(chǎn)，可節(jié)約大量種子，且可固定雜種優(yōu)勢(shì)。胚狀體一旦形成即可長(zhǎng)成為小植株，成苗率高。胚狀體是從單細(xì)胞直接分化成小植株，而其它再生植株的方式，一般要經(jīng)過(guò)愈傷組織階段，時(shí)間上要慢得多。在細(xì)胞、愈傷組織和器官的培養(yǎng)中，一個(gè)培養(yǎng)物上誘導(dǎo)胚狀體的數(shù)量，往往比誘導(dǎo)芽的數(shù)量要多得多。產(chǎn)生胚狀體的離體培養(yǎng)物也是多種多樣的，離體的根、莖、葉、花芽、花藥、 幼苗、子葉、子房中的合子胚、胚狀體、多種單細(xì)胞、游離的小孢子以及原生質(zhì)體，都曾記錄過(guò)有直接或間接（ via callus）產(chǎn)生胚狀體的能力。 一、植物胚狀體發(fā)生的普遍性 由于培養(yǎng)的植物組織細(xì)胞一般是體細(xì)胞，因而將由離體培養(yǎng)的組織細(xì)胞分化出的胚叫體細(xì)胞胚 (somatic embryo)；又由于離體培養(yǎng)的植物組織細(xì)胞是在未經(jīng)過(guò)有性過(guò)程的情況下直接產(chǎn)生胚這一結(jié)構(gòu)，并且形成的胚與性細(xì)胞形成的胚相似，因此也將此類胚稱為胚狀體（ embryoid）。 溫度：不同植物不一樣，需要摸索，如煙草和棉花就不一樣。盡管如此，多數(shù)植物需要一個(gè)穩(wěn)定的光周期，多數(shù)培養(yǎng)條件是 1416h 光照， 810h 黑暗。在促進(jìn)芽的分化中， BAP是最有效的。同時(shí)，auxion/cytokinin 之比值的變化成為特定的器官、根或芽分