【正文】 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)教案（課時(shí)備課） 第 1415 次課 4 學(xué)時(shí)課目、課題（章節(jié)）第七章 轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要參考資料l 鄧秀新 胡春根主編 園藝植物生物技術(shù) 高等教育出版社 2005。作業(yè)布置CDNA文庫與基因組文庫的區(qū)別有哪些？課后自我總結(jié)分析學(xué)生聽起來有難度，應(yīng)結(jié)合動(dòng)畫、形象的語言使學(xué)生易于理解。cDNA文庫只反映加工成熟后mRNA的堿基序列結(jié)構(gòu)?；蚩寺∮址Q為分子克隆、基因分離、基因操作和重組DNA技術(shù)。l 植物生物技術(shù)導(dǎo)論(許亦農(nóng) 麻密 譯) 化學(xué)工業(yè)出版社l 張獻(xiàn)龍 植物生物技術(shù) 科學(xué)工業(yè)出版社，2005教學(xué)目的和要求要求同學(xué)們掌握基因分離克隆的基本原理、主要克隆策略，以及在園藝植物改良中的應(yīng)用。注：板書設(shè)計(jì)可在授課進(jìn)程中直接用橫線、浪線等標(biāo)示出。將RAPD隨機(jī)性和專一性擴(kuò)增巧妙結(jié)合，再選用內(nèi)切酶以達(dá)選擇的目的。根據(jù)兩端序列的保守性設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，電泳分離，染色顯帶以檢測(cè)微衛(wèi)星序列多態(tài)性。如此反復(fù)數(shù)十次 , 可以使單一的 DNA 序列擴(kuò)增 105107 倍。RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA）：Random amplification of Polymorphic DNA，以 PCR 為基礎(chǔ) , 利用人工合成的約 10 b的隨機(jī)序列寡核苷酸作引物 , 以生物的基因組 DNA 為模板 , 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增 , 產(chǎn)生不連續(xù)的 DNA 產(chǎn)物 , 通過瓊脂糖凝膠電泳來檢測(cè) DNA 序列的多態(tài)性。DNA標(biāo)記：一切能揭示DNA多態(tài)性的技術(shù)手段；它是DNA水平上遺傳多態(tài)性的直接反映，可分為：基于DNADNA雜交的標(biāo)記；基于PCR的DNA標(biāo)記；PCR與雜交相結(jié)合的標(biāo)記；SNP。生化標(biāo)記：可分為酶蛋白質(zhì)和非酶蛋白質(zhì)兩類。分子標(biāo)記：能明確反映遺傳多態(tài)性的外觀性狀，一般用肉眼可識(shí)別，或物理儀器便可識(shí)別的性狀。重 點(diǎn)難 點(diǎn)分子標(biāo)記的主要類型和應(yīng)用；分子標(biāo)記的基本原理。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)教案（課時(shí)備課） 第 1011 次課 4 學(xué)時(shí)課目、課題（章節(jié)）第五章 分子標(biāo)記技術(shù)主要參考資料l 鄧秀新 胡春根主編 園藝植物生物技術(shù) 高等教育出版社 2005。 作業(yè)布置；什么叫病毒？園藝作物病毒病發(fā)生和傳播有何特點(diǎn)？如何防治病毒病？園藝植物病毒鑒定有哪些方法？園藝作物病毒病如何脫除？課后自我總結(jié)分析內(nèi)容較多，脫毒原理與主要方法應(yīng)重點(diǎn)講解。3. 病原和發(fā)病規(guī)律? 由柑橘衰退病毒(Citrus Tristeza Vlrus簡(jiǎn)稱CTV)引起。③防治媒介昆蟲蚜蟲。2. 防治方法①選擇耐病砧木，如枳、酸橙、枳橙和紅桔等。指示植物墨西哥來檬、尤力克檸檬和葡萄柚上的癥狀為新長(zhǎng)出的葉片出現(xiàn)“明脈”，莖干的木質(zhì)部出現(xiàn)凹陷點(diǎn)或凹陷條溝。病樹逐漸落葉，自頂部向下枯梢，緩慢衰亡。? 大樹發(fā)病常大部分大枝或個(gè)別大枝先表現(xiàn)。苗木發(fā)病后第二年黃化不顯著，但生長(zhǎng)衰弱。? 后主側(cè)脈附近也褪綠，呈均勻黃化。由于我國(guó)目前栽培的柑橘一般采用耐病的砧木，故大多植株帶病而不表現(xiàn)明顯癥狀。 長(zhǎng)春花苗? 接種黃龍病病原，葉片出現(xiàn)黃化斑駁。③及時(shí)挖除病樹并集中燒毀。3 防治方法①實(shí)施檢疫，嚴(yán)禁病區(qū)苗木向新區(qū)、無病區(qū)調(diào)運(yùn)。開花多而早，花瓣短小肥厚，多個(gè)花朵聚集成團(tuán)，落花落果嚴(yán)重。? ③缺素型黃化，出現(xiàn)在中、晚期病樹上，葉脈及其附近呈綠色，而葉肉呈黃色，類似缺鋅、缺錳癥。1 傳播媒介—木虱2 癥狀? ①斑駁型黃化，葉片呈黃綠相問的不均勻斑塊狀，這種類型最為常見，是田間診斷黃龍病的主要依據(jù)。? 田間初侵染源來自病樹，柑橘木虱是傳病的介體昆蟲。? 該病遠(yuǎn)距離傳播，通過帶菌苗木和接穗的調(diào)運(yùn)。? 操作方法：試管砧木苗的培養(yǎng)　　　　　　莖尖消毒和嫁接　　　　　　移栽試驗(yàn)　　　　　　病毒鑒定六 幾種常見園藝病毒病及脫除（一）柑橘黃龍病病癥? 黃龍病又名黃梢病，國(guó)外稱青果病，是國(guó)內(nèi)外檢疫對(duì)象。莖尖嫁接脫毒的原理? 莖尖微芽嫁接脫毒：根據(jù)一般病毒在植物體內(nèi)分布不均勻，頂端生長(zhǎng)點(diǎn)的分生組織不帶毒或檢查不到病毒的原理，通過莖尖嫁接脫毒得到無毒苗。此后后，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)柑橘研究所為全國(guó)柑橘主產(chǎn)區(qū)培養(yǎng)了大批技術(shù)骨干。五 莖尖微芽嫁接脫毒? 培養(yǎng)無病毒植株? 解決生根難的問題? 莖尖嫁接苗無童期的，能快開花結(jié)果。三 莖尖脫毒1．White（1943年）首先發(fā)現(xiàn)了感染煙草花葉病毒的煙草植株生長(zhǎng)點(diǎn)附近病毒濃度很低；2．Morel等（1953）從感染花葉病毒的大麗菊分離出了莖尖分和組織，并得到無病毒植株。 ? PCR技術(shù) 病毒和類病毒的基因組成已經(jīng)明確，可以根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行PCR檢測(cè) ? 核酸雜交技術(shù) 探針第三節(jié) 園藝植物病毒脫除技術(shù)一 無病毒的培育方法? 熱處理? 莖尖培養(yǎng)脫毒? 其它組織培養(yǎng)脫毒? 莖尖微芽嫁接脫毒? 熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒? 化學(xué)治療脫毒二、熱處理脫毒? 柑橘黃龍病50℃50min 蒸氣或37℃， 3周? 柑橘衰退病40/30變溫，7－12周? 柑橘碎葉病40/30變溫，8周? 草莓斑駁病37－38 ℃， 2周? 通常，熱處理對(duì)球狀、線狀病毒、類菌質(zhì)體、類細(xì)菌體是有效的。在自然情況下形成棒狀或三葉草狀的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在常規(guī)電泳條件下遷移較快；在變性條件下，由于二級(jí)結(jié)構(gòu)破壞而成環(huán)狀，在電泳介質(zhì)中遷移減緩，而與其它小分子物質(zhì)分開，表現(xiàn)類病毒的特有電泳條帶。 (3)直接組織免疫雜交分析（Direct tissue blot immunoassay，DTBIA） ? 也稱組織免疫印跡ELISA（Tissue printing ELISA）分析，是ELISA的另一形式，其原理與ELISA相似，所不同的是用一種特殊的薄膜代替常規(guī)的微量板作固相支持物，酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生的是不可溶的有色物質(zhì)沉積在帶病毒的部位，觀察有色物質(zhì)即可判斷是否帶有病毒。首先用病毒特異性抗體（IgG）包被微板孔，然后加入待檢樣品粗提液，使包被的抗體捕捉樣品中的病毒粒子，再加入酶標(biāo)抗體，最后加入底物，室溫避光放置一定時(shí)間后，判斷結(jié)果A蛋白酶聯(lián)免疫吸附法（Protein A sandwich ELISA，PASELISA） ? 為一種間接法。 抗原吸附→免疫修飾→染色→透射電鏡觀察 (2) 酶聯(lián)免疫吸附分析（Enzymelinked Immunosorbent Assay，ELISA） 酶聯(lián)免疫吸附分析（Enzymelinked Immunosorbent Assay，ELISA） ? 具有檢測(cè)靈敏度高、快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，不需要提純病毒，可在較短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)大量樣品。 （三）常用血清學(xué)檢測(cè)方法 （1)免疫電鏡技術(shù)（Immunoelectron microscopy，IEM）是將抗原與抗體的?；悦庖叻磻?yīng)與電鏡觀察相結(jié)合的一種病毒檢測(cè)方法。常用動(dòng)物為家兔，一般選用半周歲左右、體重2－3千克、健康、這些抗體是由動(dòng)物的多種淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生的，因此也稱為多克隆抗體（Polyclonal antibody，Pab）(2) 單克隆抗體 單克?。∕onoclone）即是單一的無性細(xì)胞系，或稱單細(xì)胞系。 ? 病毒抗原的制備方法，主要步驟包括分步沉淀、差速離心和梯度離心等,去雜質(zhì)濃縮病毒。? 兼具這兩種特性的抗原物質(zhì)稱為完全抗原；只有反應(yīng)原性，沒有免疫原性的抗原物質(zhì)稱為半抗原。 （二）木本指示植物鑒定 ? 常用木本指示植物? 接種方法 （1）雙重芽接法 （2）雙重切接法 （3）指示植物直接嫁接法二 血清學(xué)檢測(cè) ? 抗原（antigen）：凡注射到動(dòng)物體內(nèi)能刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的物質(zhì)均可稱為抗原。 ? 接種方法 汁液摩擦法，從待檢植株上取一定的組織，包括葉片、花瓣、根、或枝皮，加入2~5倍（V/W）的提取緩沖液，在低溫條件下研磨，然后蘸取汁液在撒有金剛砂的供試指示植物葉片上輕輕摩擦，接種完畢立即用蒸餾水沖洗凈葉片上殘留的汁液。常用的接種方法包括汁液摩擦接種和嫁接傳染。有些鑒別寄主對(duì)病毒的侵染易產(chǎn)生枯斑，因此將產(chǎn)生枯斑的寄主也稱為枯斑寄主。一個(gè)重要的策略就是利用來源于病毒本身的基因，這種通過將病原物基因?qū)胫参锒@得的抗病性稱為病原獲得抗病性（Pathogen acquired resistance，PAR）。這類病原引起的病害發(fā)病規(guī)律相似，均可通過嫁接傳染，許多還可經(jīng)由介體昆蟲傳播，在防治策略上也有相同之處。 螺原體（spiroplasma）167。 類病毒（viroid）167。167。? 潛伏侵染（latent infection），這類病毒稱為潛隱病毒（latent virus）。? 病毒是傳染性寄生物，它的核酸基因組的重量小于3108道爾頓，需要有寄主細(xì)胞中的核糖體和其它成分才能增殖。病毒個(gè)體相當(dāng)微小，大多數(shù)病毒在100～300毫微米之間。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)教案（課時(shí)備課） 第 89 次課 4 學(xué)時(shí)課目、課題（章節(jié)）第四章 病毒病檢測(cè)與脫除主要參考資料l 鄧秀新 胡春根主編 園藝植物生物技術(shù) 高等教育出版社 2005。 breeding作業(yè)布置；原生質(zhì)體培養(yǎng)有何意義？原生質(zhì)體培養(yǎng)影響因素有哪些？體細(xì)胞融合與自然生殖過程的融合有何異同？如何增強(qiáng)體細(xì)胞融合過程雙親遺傳物質(zhì)的選擇性分配？課后自我總結(jié)分析：內(nèi)容較多，應(yīng)側(cè)重原生質(zhì)體培養(yǎng)、融合原理與方法以及體細(xì)胞雜種的主要應(yīng)用，輔以典型實(shí)例，避免過多介紹柑橘體細(xì)胞雜交。SH Identificationl Morphology: leaf shape, thickness, stoma density amp。 融合液：CaCl2 2H2O 8~10mmol KH2PO4 甘露醇或山梨醇 ~ pH 誘導(dǎo)液：融合液＋PEG 20～45％ 稀釋液：A液（g/100ml） B液 (g/100ml) 葡萄糖 甘氨酸 CaCl2 2H2O NaOH 2．電融合法 2) Defects include: tedious fusion procedure, toxicity to cells. safe ‘biotech’ for plant breeding in citrus, rapeseed, wheat etc.二、原生質(zhì)體融合（一） 融合方法1. PEGmediated fusionSH, . protoplast fusion, a process of PPs from two different parents were induced to fuse and then regenerate into plantlets, also named as SH (A + B)l 幾種不同的表述： 體細(xì)胞雜交：Somatic hybridization 細(xì)胞融合：Cell fusion 原生質(zhì)體融合：Protoplast fusion 無性雜交：asexual hybridization 超性雜交：Parasexual hybridization 超性融合：Parasexual fusion 細(xì)胞操作：Cell manipulation 細(xì)胞工程（Cell engineering）相關(guān)的術(shù)語（Terminology）l 對(duì)稱雜種 (symmetric hybrid)（雙親給雜種貢獻(xiàn)的遺傳物質(zhì)均為100%）l 非對(duì)稱雜種(asymmetric hybrid)（雙親給雜種貢獻(xiàn)的遺傳物質(zhì)不等（相對(duì)值）l 胞質(zhì)雜種（cytoplasmic hybrid, Cybrid）：細(xì)胞質(zhì)重組，細(xì)胞核未重組l 對(duì)稱融合（symmetric fusion），也稱標(biāo)準(zhǔn)融合（Standard fusion）l 非對(duì)稱融合（asymmetric fusion）：融合前對(duì)一方進(jìn)行處理，使其染色體丟失一部分l 供受體融合：Donorrecipient fusionl 體配融合（gametosomatic fusion）（性細(xì)胞與體細(xì)胞融合）l 亞原生質(zhì)體原生質(zhì)體融合： Subprotoplastprotoplast fusion 小原生質(zhì)體：Miniprotoplast 微原生質(zhì)體：Microprotoplast 胞質(zhì)體：Cytoplastl 胞質(zhì)體原生質(zhì)體融合: Cytoplastprotoplast fusionTechnical developmental history1) 1970s, establish and optimize of PP technique2) 1972, tobacco interspecific somatic hybrid3) 1975, high Cahigh pH PEG fusion。 l 原生質(zhì)體再生植株的變異可為體細(xì)胞遺傳學(xué)研究和作物改良提供有用的材料。– Grosser等（1984）報(bào)道由三葉草葉肉原生質(zhì)體再生的植株為二倍體（2n = 16），而由培養(yǎng)細(xì)胞分離的原生質(zhì)體再生的植株為四倍體（2n = 32）。起始培養(yǎng)密度與培養(yǎng)基– 基本起始密度 適宜密度