【文章內(nèi)容簡介】 實；通過胚乳培養(yǎng)，探索改良農(nóng)林、園藝植物三倍體育種技術(shù)的可能性。研究離體培養(yǎng)條件下胚和胚乳的關(guān)系。迄今已有40多種植物進行胚乳培養(yǎng)。蘋果、柚、甜橙、檀香、枸杞、獼猴桃、玉米、大麥、小黑麥、水稻、馬鈴薯、梨、核桃等胚乳培養(yǎng)再生了植株。三 花藥和花粉培養(yǎng)（一） 圖示流程（二） Anther/Microspore Culture Factorsl Genotype– As with all tissue culture techniquesl Growth of mother plant– Usually requires optimum growing conditionsl Correct stage of pollen development– Need to be able to switch pollen development from gametogenesis to embryogenesis大多數(shù)園藝作物花粉培養(yǎng)適宜的時期為盛花期、處于單核中期至晚期的花粉（單核靠邊期）l Pretreatment of anthers– Cold or heat have both been effectivel Culture media– Additives, Agar vs. ‘Floating’（三） 花粉培養(yǎng)方法有二種方法，l 一種是將接種的花藥在培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)數(shù)天，然后將花粉分離出來進行懸浮培養(yǎng)，小孢子便可以啟動發(fā)育；l 另一種 取出經(jīng)消毒處理的花蕾中的花藥，放在加有4～5ml的液體培養(yǎng)基的小燒杯中。用玻棒或鑷子擠壓花藥，使花粉從花藥中釋放出來。再根據(jù)不同植物花粉粒的大小，選用孔徑大小合適的尼龍網(wǎng)（孔徑20～60μm）過濾，除去藥壁組織。過濾后的花粉液再經(jīng)低速離心（100～160r/min）3min，將沉淀用新鮮培養(yǎng)期稀釋，重復(fù)兩次，可得到較純凈的花粉群體。然后將花粉進行懸滴培養(yǎng)和液體淺層培養(yǎng)。 （四）花粉培養(yǎng)的培養(yǎng)基l 基本培養(yǎng)基 MS、Nitsch、White和NNLN、B5等，其中花粉培養(yǎng)以MS、Nitsch或White最為常用l 碳源 以蔗糖效果較好，一般花藥培養(yǎng)蔗糖濃度為6%～10%，花粉培養(yǎng)則要求13%左右，不同植物種類品種所需蔗糖濃度有些差異。l 生長素和細胞分裂素比較常用，一般低濃度的生長素類物質(zhì)可提高胚狀體的誘導(dǎo)率而高濃度則易使胚狀體發(fā)生愈傷組織化和使單細胞倍性復(fù)雜化。 作業(yè)布置；l 概念：組織培養(yǎng)、體細胞無性系變異、外植體、愈傷組織、胚狀體、細胞全能性、離體保存等l 簡答題：l 簡述組織培養(yǎng)室的基本設(shè)施；l 簡述培養(yǎng)基配制的基本流程、應(yīng)注意哪些方面？l 簡述組織培養(yǎng)技術(shù)主要有哪些應(yīng)用？課后自我總結(jié)分析該章是本課程的重點，是同學(xué)們畢業(yè)后可以應(yīng)用的最基礎(chǔ)技術(shù)；除技術(shù)外，同學(xué)們對基本建立起一個組培實驗室也很有興趣。注：板書設(shè)計可在授課進程中直接用橫線、浪線等標示出。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)教案（課時備課） 第 67 次課 4 學(xué)時課目、課題（章節(jié)）第三章 原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細胞融合主要參考資料l 鄧秀新 胡春根主編 園藝植物生物技術(shù) 高等教育出版社 2005。l 植物生物技術(shù)導(dǎo)論(許亦農(nóng) 麻密 譯) 化學(xué)工業(yè)出版社l 肖尊安 植物生物技術(shù) 化學(xué)工業(yè)出版社教學(xué)目的和要求通過本次學(xué)習，要求同學(xué)們掌握原生質(zhì)體操作的意義、基本步驟及應(yīng)用，體細胞雜交的概念、融合方法方式、在育種中的應(yīng)用。重 點難 點原生質(zhì)體分離培養(yǎng)步驟、主要應(yīng)用；原生質(zhì)體培養(yǎng)方法。原生質(zhì)體融合方法/方式、主要應(yīng)用；體細胞雜種的遺傳鑒定。教學(xué)進程（含教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)方法、 輔助手段、師生互動、學(xué)時分配、板書設(shè)計）第一節(jié) 原生質(zhì)體培養(yǎng)一、原生質(zhì)體研究概況（一）原生質(zhì)體的概念l Protoplast (原生質(zhì)體): a naked cell without cell walll Subprotoplast (亞原生質(zhì)體):inplete protoplast with or without nucleusl Nucleoplast (核質(zhì)體): nuclear protoplast with little cytoplasm (由原生質(zhì)膜和薄層細胞質(zhì)包圍細胞核形成的小原生質(zhì)體，即小原生質(zhì)體) (Miniprotoplast)l Microprotoplast: protoplast with one or a few chromosomesl Cytoplast (胞質(zhì)體): enucleated protoplast (不含細胞核而僅含部分胞質(zhì)的原生質(zhì)體) (二) 原生質(zhì)體研究進展Key achievements in plant PP research1880, protoplast was first used by Hanstein1960, PP isolation from tomato root by enzyme incubation by Cocking1971, mesophyll PP plant regeneration in tobacco by Takebe1981, embryogenic PP plant regenration by Vardi in Isreal1985, First Rice PP plant regeneration by Fujimura1986, single PP culture amp。 plant regeneration in Rapeseed by SpangenbergFact sheet in plant PP researchIn Horticultural crops, citrus ranks first in PP research.PP plant regeneration succeeded in citrus, persimmon, banana, apple, pear, grape, kiwi, etc.PP regeneration succeeded in over 320 plant species belonging to 49 families amp。 146 genera.Tendency: model plants to staple amp。 economic plants。 annual to perennial plants.PP plant regeneration is possible from almost all kinds of higher plants.二、原生質(zhì)體分離（一）原生質(zhì)體分離的材料準備l 無菌試管苗葉片l 上胚軸和子葉l 培養(yǎng)細胞（二）預(yù)處理及酶解l 酶溶劑及其滲透壓溶劑：原生質(zhì)體培養(yǎng)基或特殊配制。滲透壓調(diào)節(jié)劑：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。 l 材料預(yù)處理– 在游離原生質(zhì)體前對供體材料進行預(yù)處理及預(yù)培養(yǎng)，可提高原生質(zhì)體的活力和分裂頻率。– 用黑暗處理、低溫處理和不同光質(zhì)照射等方法，可提高原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力。不同植物及材料類型預(yù)處理方法不同。– 例如，龍膽試管苗的葉片只有用4℃低溫處理，甘蔗植株必須先在黑暗條件下培養(yǎng)12 h后分離的原生質(zhì)體才能分裂，柑橘離體葉片在上午、溫室葉片在遮蔭、適宜溫度（2630 C）條件下分離效果較好。l 酶處理 l 原生質(zhì)體收集和純化– 過濾 400200目(40100μ）– 界面離心法：13%甘露醇/25%蔗糖– 飄浮法：常用的飄浮劑有蔗糖、Percoll、Ficoll。– 沉淀法：常用甘露醇作為滲透壓調(diào)節(jié)劑，先將酶液洗干凈，再用Percoll飄浮一次。 (三)原生質(zhì)體活力測定l 目測法：在顯微鏡下觀察，根據(jù)細胞形態(tài)、流動性確定原生質(zhì)體活力。l FDA法：FDA（二乙酸熒光素）是一種非極性物質(zhì)，能自由地穿越細胞質(zhì)膜，在活細胞內(nèi)，F(xiàn)DA被酯酶裂解即發(fā)熒光（熒光素），由于熒光素不能自由通過質(zhì)膜，因而可在熒光顯微鏡下通過具熒光細胞的觀察確定細胞活性。l 伊凡藍法：伊凡藍不能穿過質(zhì)膜，只有質(zhì)膜受到嚴重損壞使，細胞才能被染色，因而可以通過細胞被染色與否確定活性。 （四）影響原生質(zhì)體活力的因素l 分離材料的生理狀態(tài)l 酶解條件：酶質(zhì)量、濃度、酶解溫度、酶解時間、酶溶液的滲透壓l 分離條件：離心次數(shù)、離心速度、純化方法、分離持續(xù)時間l 環(huán)境條件：操作環(huán)境的溫度、分離用具的影響 三、原生質(zhì)體培養(yǎng)（一）原生質(zhì)體培養(yǎng)基1．無機鹽l 大量元素濃度；l NO3－和NH4+的比例；對某些植物原生質(zhì)體分裂有抑制作用。有些僅用有機氮，如在菊苣原生質(zhì)體培養(yǎng)中，將培養(yǎng)基中的氨和硝酸鹽全部去掉，只以谷氨酰胺作為氮源，培養(yǎng)效果很好(Grep，1982)。l Ca2+濃度 較高的ca”濃度能提高原生質(zhì)體的穩(wěn)定性，有利于原生質(zhì)體生長和發(fā)育2．有機成分l 維生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。 3. 激素l 常用的激素：NAA、IAA、BA與2,4D 4. 滲透壓l 常用的滲透壓調(diào)節(jié)劑：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。l 原生質(zhì)體的滲透壓原則：培養(yǎng)基滲透壓與細胞滲透壓等滲。 （二）原生質(zhì)體培養(yǎng)方法l 液體淺層培養(yǎng):Liquid thin layer culturel 固體平板培養(yǎng):Solid culturel 液體－固體雙層培養(yǎng):Liquid solid culturel 瓊脂糖珠培養(yǎng):Agarose bead culture（三）原生質(zhì)體發(fā)育與植株再生1. 細胞壁再生原生質(zhì)體培養(yǎng)數(shù)小時后開始再生新的細胞壁，一至數(shù)天內(nèi)便可形成完整的細胞壁。％熒光增白劑（Calcofluor）染色后在熒光顯微鏡下觀察，可見到綠色熒光圍繞細胞表面，證明細胞壁已經(jīng)形成。也可用高滲溶液產(chǎn)生質(zhì)壁分離的方法、電子顯微鏡觀察技術(shù)和冰凍蝕刻法等進行再生細胞壁的研究。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，原生質(zhì)體培養(yǎng)數(shù)小時后新壁開始形成，先是質(zhì)膜合成形成細胞壁主要成分的微纖維，然后轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜表面進行聚合作用產(chǎn)生多片層的結(jié)構(gòu)，以后在質(zhì)膜與片層結(jié)構(gòu)之間或在膜上產(chǎn)生小纖維絲，逐漸形成不定向的纖維團，最后形成完整的細胞壁。只有能形成完好細胞壁的再生細胞才能進入細胞分裂的階段。 2. 細胞分裂和生長原生質(zhì)體培養(yǎng)數(shù)天后，胞質(zhì)增加，細胞器增殖，RNA、蛋白質(zhì)及多聚糖合成增加，不久即可發(fā)生核的有絲分裂及胞質(zhì)分裂。原生質(zhì)體一般培養(yǎng)2～7 d后開始第1次分裂，但開始第1次分裂的時間隨植物的種類、分離原生質(zhì)體的材料、原生質(zhì)體的質(zhì)量、培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件而異。用幼苗下胚軸和子葉、幼根、懸浮培養(yǎng)的細胞、未成熟種子的子葉等材料分離原生質(zhì)體，一般比用葉肉分離原生質(zhì)體容易誘導(dǎo)分裂，第一次分裂出現(xiàn)的時間較快。3. 愈傷組織形成 大多數(shù)情況下原生質(zhì)體培養(yǎng)二周后，形成多細胞的細胞團，三周后形成肉眼可見的小細胞克隆，大約六周后形成直徑1 mm的小愈傷組織。 原生質(zhì)體培養(yǎng)7～10天后必需及時添加新鮮培養(yǎng)基，否則形成的細胞團不繼續(xù)生長。待小愈傷組織長至1 mm左右時應(yīng)及時轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基上使其進一步生長。（四）影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的主要因素 l 基因型l 原生質(zhì)體來源l 起始培養(yǎng)密度與培養(yǎng)基– 基本起始密度 適宜密度為15105/ml左右 – 培養(yǎng)基激素水平（柑橘不要激素可以再生）– 密度與培養(yǎng)基營養(yǎng)成分完全性 五、原生質(zhì)體再生植株遺傳及變異 （一）染色體變異l 染色體倍性變異是原生質(zhì)體再生植株的常見變異類型l 原生質(zhì)體再生植株的倍性與分離原生質(zhì)體的起始材料有關(guān)。– 由莖尖、葉肉和胚性組織的細胞分離的原生質(zhì)體能較好地保持原來的倍性；– 用懸浮培養(yǎng)細胞特別是長期繼代培養(yǎng)的細胞系分離的原生質(zhì)體，較易出現(xiàn)染色體倍性及數(shù)目的變化。– Grosser等（1984）報道由三葉草葉肉原生質(zhì)體再生的植株為二倍體（2n = 16），而由培養(yǎng)細胞分離的原生質(zhì)體再生的植株為四倍體（2n = 32）。 l 原生質(zhì)體再生植株變異還與植物種類有關(guān)(二)植株表型變異l 原生質(zhì)體再生植株表型變異包括植物學(xué)性狀、同功酶譜、抗性變異l 變異程度的大小與起始材料及培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的變異有關(guān)。 l 原生質(zhì)體再生植株的變異可為體細胞遺傳學(xué)研究和作物改良提供有用的材料。第二節(jié) 體細胞雜交一、體細胞雜交的概念l 概念：體細胞雜交，即原生質(zhì)體融合，將兩個不同親本的原生質(zhì)體，經(jīng)人工誘導(dǎo)融合并培養(yǎng)再生成株的過程，統(tǒng)稱為體細胞雜交（A + B）。SH, . protoplast fusion, a process of PPs from two different parents were induced to fuse and then regenerate into plantlets, also named as SH (A + B)l 幾種不同的表述： 體細胞雜交：Somatic hybridization 細胞融合：Cell fusion 原生質(zhì)體融合：Protoplast fusion 無性雜交：asexual hybridization 超性雜交：Parasexual hybridization 超性融合：Parasexual fusion 細胞操作：Cell manipulation 細胞工程（Cell engineering）相關(guān)的術(shù)語（Terminology）l 對稱雜種 (symmetric hybrid)（雙親給雜種貢獻的遺傳物質(zhì)均為100%）l 非對稱雜種