【文章內(nèi)容簡介】 hogen resistance Herbicide resistance bioreactors Delivery systems （一）目的基因的獲取 目的基因的來源 Endogenous genes (Plant genes) Gene discovery (functional genomics) Applications markers transgenic Enzymes in biochemical pathway Natural resistance genes Marker assisted breeding Plant improvement Mapping ESTs, libraries Silencing, expression Mutants, arrays （ 1）化學合成 （ 2）篩選基因組文庫或 cDNA文庫 （ 3） PCR方法 （ Polymerase Chain Reaction ） （ 4）圖位克隆 （ mapbased cloning）與染色體步移 （ chromosome Walking） （ 5） 酵母雙雜交體系 Twohybrid system 目的基因的獲得 （ 1）化學法直接合成基因 針對已經(jīng)知道序列和分子結(jié)構的基因，在實驗室進行人工合成。 1977年， K. Itakura利用化學途徑首次合成了編碼腦激素的基因（生長激素釋放因子基因），并在大腸桿菌中實現(xiàn)了成功的表達。從此，化學合成基因得到了很大的發(fā)展迅速。 早期通過化學合成的部分基因 基因 人胰島素 轉(zhuǎn)運 RNA ?干擾素 腸促胰液肽 尿抑胃激素 ?干擾素 大小（ bp） 126 542 81 162 453 合成年代 1978 1979 1981 1982 1982 1984 基因 視紫紅質(zhì) 前腦菲肽 ATP酶 溶菌酶 RNA酶 T1 RNA酶Ａ 大?。?bp） 1057 77 170 385 324 375 合成年代 1985 1985 1985 1985 1986 1987 （ 2）通過篩選基因組文庫和 cDNA文庫克隆目的基因 基因組 DNA文庫（ genomic DNA library） 指將某生物的全部基因組 DNA切割成一定長度的DNA片斷，克隆到某種載體上而形成的集合。 基因組 DNA DNA片斷 連接克隆載體 重組 DNA分子 含重組分子的轉(zhuǎn)化菌 限制性內(nèi)切酶酶切 受體菌 cDNA文庫 (plementary DNA library ， cDNA) 指生物某一發(fā)育時期或某一特定組織所轉(zhuǎn)錄的 mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的 cDNA片斷與某種載體連接而形成的克隆的集合。 m R N A逆 轉(zhuǎn) 錄 酶c D N A復 制雙 鏈 c D N A載 體重 組 D N A 分 子受 體 菌含 重 組 分 子 的 轉(zhuǎn) 化 菌?從基因庫中篩選、分離基因，可據(jù)對待選基因相關信息的了解程度，確定篩選方法和條件。 ?大多數(shù)方法是利用一段核苷酸序列 (DNA， cDNA或寡核苷酸 )作探針 (probe)，用放射性同位素或非放射性同位素標記探針，也可用抗體作探針，篩選基因庫。 如菌斑雜交法 (plaque hybridization)篩選 λ噬菌體核基因庫。 （ 3 ） 通過 聚合酶鏈式反應 （ PCR） 方法克隆 使用 PCR法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴增目的基因或 DNA片段兩側(cè)的序列，根據(jù)該序列化學合成聚合反應必需的雙引物 。 ?PCR技術就是在體外中通過酶促反應有選擇地大量擴增（包括分離）一段目的基因的技術。 加入 4種物質(zhì)： （ 1） 作為模板的 DNA序列； （ 2）與被分離的目的基因兩條鏈 各自 5’端序列相互補的DNA引物（ 20個左右堿基的短 DNA單鏈）； （ 3） TaqDNA聚合酶； （ 4） dNTP（ dATP, dTTP, dGTP和 dCTP）。 ? 聚合酶鏈式反應 （ PCR） 變性、退火、延伸三步曲 ? 變性： 雙鏈 DNA解鏈成為單鏈 DNA ? 退火： 部分引物與模板的單鏈 DNA的特定互補部位相配對和結(jié)合 ? 延伸： 以目的基因為模板，合成互補的 新DNA鏈 聚合酶鏈式反應 （ PCR） 每一輪聚合酶鏈式反應可使目的基因片段增加一倍 ?30輪循環(huán)可獲得 —— 230（ 109)個基因片段 基于 PCR方法克隆目的基因的方法如： ?mRNA差別顯示技術（ DDPCR） ?RTPCR ?RACE分離 cDNA全長 ?TAILPCR ?代表性差異分析（ cDNA RDA） ?抑制消減雜交法（ SSH） (4)圖位克隆和染色體步移方法分離目的基因 染色體步移 (chromosome walking) 是通過逐一克隆來自染色體基因組 DNA 的彼此重復的序列 ,而慢慢的靠近目的基因開始步移的克隆可以是已知的基因、 RFL Ps、 RAPDs 或其它已鑒定的分子標記 ,用它來雜交篩選大片段 DNA 文庫中的陽性克隆 ,這樣就得到了“一步”克隆 ,進一步的走步工作需要新的雜交探針 , 利用新獲得的探針對文庫進行第二次雜交 ,得到了與探針具重復序列的陽性克隆 ,稱為“二步”克隆 ,理論上講 ,這就向前步查了兩步。遠距離的目的基因通過這樣周而復始的查步而獲得。 （ 5）通過酵母雙雜交方法克隆目的基因 酵母雙雜交技術的基本原理 （二）植物表達載體的構建 在植物基因轉(zhuǎn)化過程中，已建立了多種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，如 載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)， DNA直接導入轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，基因槍導入轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，花粉管介導轉(zhuǎn)化系統(tǒng) 等，但 載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng) 是目前使用最多、技術最成熟、成功實例最多的一種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，也是植物基因工程最重要的一種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，因此所謂植物基因工程載體主要是指這一類載體，它具體包括 Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體、 Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體及病毒轉(zhuǎn)化載體，其中 Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體是最主要的。 cause ‘Crown gall’ disease A natural DNA delivery system Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium is a ‘natural geic engineer’ . it transfers some of its DNA to plants ? A plant pathogen found in nature ? Infects many plant species ? Delivers DNA that encodes for plant hormones ? DNA incorporates into plant chromosome ? Hormone genes expressed and galls form at infection site 1. Auxin, cytokinin, opine synthetic genes transferred to plant 2. Plant makes all 3 pounds 3. Auxins and cytokines cause gall formation 4. Opines provide unique carbon/nitrogen source only A. tumefaciens can use! 天然 Ti質(zhì)粒的主要功能基因： 用于天然的 Ti質(zhì)粒必須要進行改造，才能用于基因工程，有幾個重要問題必須解決： (1)Ti 質(zhì)粒太大，很難進行分子生物學操作； (2)在大腸桿菌中要易于操作； (3) 轉(zhuǎn)化植物后，能夠易于篩選，不能有致瘤性； (4)單一的限制性內(nèi)切酶位點，以便外源基因的插入 TDNA中。 天然 Ti質(zhì)粒和工程改造 Ti質(zhì)粒的差異 包括選擇標記基因、報告基因和目的基因 一些常見的遺傳選擇標記和報告基因 （ Reporter Genes/Selectable Markers） ?Neomycin Phosphotransferase gene(nptII) 抗卡那霉素 ?Hygromycin(hpt) 抗潮霉素 ?Phosphinothricin(bar) 抗除草劑 ?GUS βglucuronidase enzyme which converts colorless substrate to blue product β 葡萄糖苷酸酶基因 ?Luciferase (firefly) GFP 綠色熒光蛋白基因 目前主要采用兩種質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化載體系統(tǒng)，一元載體系統(tǒng)和二元載體系統(tǒng)，目前在植物轉(zhuǎn)化中大多是二元載體系統(tǒng)。 Cointegrative 一元共整合載體 Binary vector 二元載體 LB RB 用于植物轉(zhuǎn)化的工程質(zhì)粒pCAMBIA1300圖譜 pB19hpc (Golden Rice Cassette) TL TR aphIV 35S Gt1 psy 35S rbcS crtl Hygromycin Resistance Phytoene Synthase Phytoene Desaturase TDNA Border TDNA Border Selectable Marker Gene of Interest Gene of Interest Insertion Sequence Insertion Sequence 用以轉(zhuǎn)化的載體部分結(jié)構。 （三）植物遺傳轉(zhuǎn)化方法 ? 農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化 ? 基因槍介導的遺傳轉(zhuǎn)化 ? 花粉管通道法 農(nóng)桿菌介導的植物遺傳轉(zhuǎn)化 農(nóng)桿菌介導法植物轉(zhuǎn)基因的原理 Agrobacteriummediated plant transformation Agrobacterium tumefaciens mediated plant transformation 農(nóng)桿菌介導的植物遺傳轉(zhuǎn)化必須具備 2個前提： ?植物能夠被農(nóng)桿菌侵染 單子葉不易侵染，雙子葉植物容易侵染。 ?植物比較容易再生 regenerable cells Transformed cells Cells containing new DNA that are able to regenerate into a new plant 基因槍轉(zhuǎn)化法 (biolistics) ? uses a ‘gene gun’ ? DNA is coated onto gold (or tungsten) particles (inert) ? gold is propelled by helium into plant cells ? if DNA goes into the nucleus it can be integrated into the plant chromosomes ? cells can be regenerated to whole plants The Gene Gun PDS1000 Microparticle Delivery System Helium chamber Rupture disk Macrocarrier DNA coated gold particle Stopping screen Focusing device Target tissue 基因槍轉(zhuǎn)化方法在單子葉植物如玉米、水稻等用的較多。 （四）轉(zhuǎn)化細胞的篩選及轉(zhuǎn)基因植株鑒定 抗性篩選 報告基因 核酸雜交 PCR檢測 轉(zhuǎn)基因水稻根、莖和葉的 GUS組織化學分析 A B C a b c a b c a b c A, 根系； B, 莖桿； C, 葉片。 a, Gus 基因由 35S啟動子驅(qū)動； b, Gus 基因由蔗糖合酶基因 RSuS1的啟動子序列驅(qū)動； c, 未轉(zhuǎn)基因水稻植株。 A, roots。 B, stems。 C, leaves. a and b represent the Gus gene is drived by 35S and RSuS1 promoter respectively。 c, notransformed plants as negative control. 以 GFP為報告基因的轉(zhuǎn)基因植株和