【正文】 Biotechnology of Horticultural Plant園藝植物生物技術(shù)（理論課教案）華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院200720081華中農(nóng)業(yè)大學(xué)教案（首頁） 授課時(shí)間 2007年911月 教案編寫時(shí)間 2007年8月 課程名稱園藝植物生物技術(shù)課程編號總學(xué)時(shí) 40講課： 30 學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)： 10 學(xué)時(shí)實(shí)習(xí)： 學(xué)時(shí)學(xué) 分 數(shù)課型必修課（214。） 選修課（ ）理論課（214。） 實(shí)驗(yàn)課（ ）任課教師郭文武、程運(yùn)江職稱教授、副教授（博士）授課對象2002（班）級 園藝 專業(yè) 2班基本教材或主要參考書園藝植物生物技術(shù)，鄧秀新、胡春根主編。高等教育出版社，2005 植物生物技術(shù)導(dǎo)論(許亦農(nóng) 麻密 譯) 化學(xué)工業(yè)出版社肖尊安 植物生物技術(shù) 化學(xué)工業(yè)出版社教學(xué)目的與要求通過本課程的學(xué)習(xí)，要求園藝專業(yè)學(xué)生掌握園藝植物生物技術(shù)相關(guān)基本理論和方法。教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)重點(diǎn)：生物技術(shù)的概念/應(yīng)用現(xiàn)狀、組織培養(yǎng)技術(shù)、病毒病脫除與無病毒繁殖難點(diǎn)：原生質(zhì)體操作技術(shù)、基因分離克隆、轉(zhuǎn)基因技術(shù)教學(xué)進(jìn)程第 次課1256789101112131415授課章節(jié)（30學(xué)時(shí)） Theory part1) Introduction2) Tissue culture of hortic plant3) Protoplast culture amp。 somatic fusion4) Virus eradication, detection amp。 characterization5) Molecular markers6) Gene isolation amp。 cloning7) Transgenic techniques學(xué) 時(shí)2844444備 注本課程采用多媒體課件教學(xué)3次實(shí)驗(yàn)課，分別為實(shí)驗(yàn)室布局/大型生物技術(shù)儀器介紹、組織培養(yǎng)技術(shù)、DNA鑒定技術(shù)。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)教案（課時(shí)備課） 第 1 次課 2 學(xué)時(shí)課目、課題（章節(jié)）第一章 緒論主要參考資料l 鄧秀新 胡春根主編 園藝植物生物技術(shù) 高等教育出版社 2005。l 植物生物技術(shù)導(dǎo)論(許亦農(nóng) 麻密 譯) 化學(xué)工業(yè)出版社l 肖尊安 植物生物技術(shù) 化學(xué)工業(yè)出版社教學(xué)目的和要求l 掌握生物技術(shù)的概念、所包含的技術(shù)內(nèi)容、對園藝科學(xué)發(fā)展的貢獻(xiàn)及可能引起的深刻變化。l 了解園藝植物生物技術(shù)的發(fā)展歷程l 課程要求與安排重 點(diǎn)難 點(diǎn)l 生物技術(shù)的內(nèi)涵l 生物技術(shù)與產(chǎn)業(yè)的結(jié)合教學(xué)進(jìn)程（含教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)方法、 輔助手段、師生互動(dòng)、學(xué)時(shí)分配、板書設(shè)計(jì)）課程安排l 生物技術(shù)的概念l 組織和細(xì)胞培養(yǎng)是園藝生物技術(shù)的平臺 l 基因工程技術(shù)是未來園藝生物技術(shù)的核心 l 生物技術(shù)對園藝科學(xué)發(fā)展的貢獻(xiàn) l 園藝植物生物技術(shù)的展望 l 課程要求與安排一 生物技術(shù)的概念l 以現(xiàn)代生物學(xué)理論為基礎(chǔ)，以基因工程為核心的一系列技術(shù)的總稱。l 狹義的植物生物技術(shù)：在離體條件下，對植物（細(xì)胞）進(jìn)行遺傳改良或使其增殖的各種技術(shù)的總稱，包括細(xì)胞水平、分子水平兩個(gè)大的層面。l 細(xì)胞學(xué)以及分子生物學(xué)是生物技術(shù)的基礎(chǔ)?！癇iotechnology” means any technological application that uses biological systems, living organisms, or derivatives thereof, to make, or modify products or processes for specific use.二 生物技術(shù)發(fā)展的歷史和作用（一）組織和細(xì)胞培養(yǎng)是園藝植物生物技術(shù)的平臺 l 18381839年，Schleiden和Schuwann提出植物和動(dòng)物均由細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞進(jìn)行分裂而增多，并組建成生物體的“細(xì)胞學(xué)說”；同時(shí)指出，若提供的條件同在活體內(nèi)一樣，每個(gè)細(xì)胞應(yīng)該能獨(dú)立生存和發(fā)展。l 1898年德國植物生理學(xué)家Haberlandt試圖通過實(shí)驗(yàn)證明該學(xué)說，于1902年發(fā)表了植物細(xì)胞培養(yǎng)方面的第一篇論文，提出了植物細(xì)胞全能性（Totipotency）的概念。這一概念是指植物的每一個(gè)細(xì)胞在一定條件下，具有發(fā)育成一棵完整植株的能力。這一概念直到1971年煙草單細(xì)胞培養(yǎng)成功才得到完全證明并成為理論。l 1943年，White出版了《植物組織培養(yǎng)手冊》。l 1958年，Steward從煙草髓細(xì)胞培養(yǎng)出完整植株，向證明細(xì)胞全能性邁進(jìn)了一大步。該結(jié)果促進(jìn)了多細(xì)胞組織和器官的培養(yǎng)研究與應(yīng)用。l 1960年Morel培養(yǎng)蘭花莖尖獲得再生植株，并證明脫除了病毒。該結(jié)果催生了蘭花工業(yè)的發(fā)展。直到今天，世界蘭花種苗基本上通過組織培養(yǎng)生產(chǎn)。同年，Cocking通過酶解法從植物組織中分離得到去除了細(xì)胞壁的原生質(zhì)體，使組織培養(yǎng)技術(shù)又向前邁進(jìn)了一步。 l 1962年，Murashige和Skoog發(fā)表了促進(jìn)煙草快速生長的培養(yǎng)基配方，即今天十分流行的MS培養(yǎng)基。 l 1964年，Guha和Maheshwari成功地從蔓陀蘿花藥培養(yǎng)得到再生植株，開創(chuàng)了花藥培養(yǎng)獲得單倍體的先河。 l 1971年，Takebe等報(bào)道了煙草原生質(zhì)體培養(yǎng)成為完整植株，至此，植物細(xì)胞全能性得到完全證明。次年，Carlson獲得煙草兩個(gè)種間的原生質(zhì)體融合再生的體細(xì)胞雜種植株。 植株組織培養(yǎng)的發(fā)展得益于兩個(gè)方面的進(jìn)展。一是對植物激素(plant hormone)的認(rèn)識，以及人工合成激素（生長調(diào)節(jié)劑，plant growth regulator，PGR）的生產(chǎn)和應(yīng)用，促進(jìn)了植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展。1934年Went發(fā)現(xiàn)了植物生長素；1956年Miller發(fā)現(xiàn)細(xì)胞激動(dòng)素。正是這些發(fā)現(xiàn)帶動(dòng)了植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展。今天，組織培養(yǎng)研究多數(shù)情況下是在摸索激素配比，也說明了植物激素研究對組織培養(yǎng)的重要性。l 第二是植物營養(yǎng)學(xué)科的發(fā)展。人們認(rèn)識了植物生長必須的營養(yǎng)物質(zhì)，利用該學(xué)科的成就，不斷改進(jìn)培養(yǎng)基配方，使得組織培養(yǎng)技術(shù)得到迅速普及。 l 植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展和成熟，有了一個(gè)離體無菌的技術(shù)平臺，人們才有可能進(jìn)行今天的轉(zhuǎn)基因研究，才會(huì)有“作物分子設(shè)計(jì)”的概念產(chǎn)生，才會(huì)有今天依賴離體培養(yǎng)的諸多技術(shù)的產(chǎn)生，如快繁技術(shù)，離體保存、莖尖微芽嫁接脫除病毒技術(shù)等?？梢哉f，組織培養(yǎng)技術(shù)是植物生物技術(shù)的基本平臺，一個(gè)作物組織培養(yǎng)技術(shù)的成熟程度可以影響其基因工程的進(jìn)展。（二）基因工程技術(shù)是未來園藝植物生物技術(shù)的核心 l 基因工程技術(shù)的發(fā)展以20世紀(jì)70年代DNA重組技術(shù)的建立為標(biāo)志。人們把1953年Watson和Crick提出的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，作為分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的里程碑。與組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展歷程類似，基因工程技術(shù)的發(fā)展得益于生物化學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞學(xué)等多個(gè)學(xué)科的發(fā)展。1983年，世界上首批轉(zhuǎn)基因煙草和馬鈴薯問世；1986年，首批轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)入田間實(shí)驗(yàn)；1993年，轉(zhuǎn)基因番茄在美國面市。盡管轉(zhuǎn)基因番茄沒有在美國得到大面積推廣應(yīng)用，但轉(zhuǎn)抗除草劑的大豆、轉(zhuǎn)抗蟲基因的玉米在美國等國家大面積推廣，產(chǎn)品已銷往世界許多國家。（三）生物技術(shù)對園藝科學(xué)發(fā)展的貢獻(xiàn) 1. 脫毒與快繁技術(shù)廣泛用于園藝作物種（苗）的生產(chǎn) 2. 花藥培養(yǎng)以及小孢子培養(yǎng)是獲得單倍體以及純合二倍體材料的最佳途徑 3. 胚搶救技術(shù)克服了果樹早熟品種選育的技術(shù)難題4. 細(xì)胞融合技術(shù)創(chuàng)造出200多例柑橘體細(xì)胞雜種 5. 分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用于育種和資源研究6. 基因克隆與遺傳轉(zhuǎn)化方興未艾（四）園藝植物生物技術(shù)的展望三、課程要求與安排l 總學(xué)時(shí)40，其中理論課30學(xué)時(shí)，實(shí)驗(yàn)課10學(xué)時(shí)l 授課教師 郭文武：博士/教授 程運(yùn)江：博士/副教授 l 要求：認(rèn)真聽講，做好實(shí)驗(yàn)，掌握基本原理和技術(shù)l 成績：平時(shí)20%，實(shí)驗(yàn)或期中20%，期末考試60%作業(yè)布置；l 生物技術(shù)包括哪些內(nèi)容？l 生物技術(shù)發(fā)展經(jīng)歷了哪幾個(gè)階段？l 生物技術(shù)對園藝生產(chǎn)可能帶來哪些革命性的進(jìn)步？l 生物技術(shù)發(fā)展過程中要注意哪些可能產(chǎn)生負(fù)面影響的問題？課后自我總結(jié)分析緒論應(yīng)講得宏觀一些，激發(fā)同學(xué)們對該課程的學(xué)習(xí)興趣，同時(shí)避免與后面各章節(jié)內(nèi)容的重復(fù)。注：板書設(shè)計(jì)可在授課進(jìn)程中直接用橫線、浪線等標(biāo)示出。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)教案（課時(shí)備課） 第 25 次課 8學(xué)時(shí)課目、課題（章節(jié)）第二章 植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)主要參考資料l 鄧秀新 胡春根主編 園藝植物生物技術(shù) 高等教育出版社 2005。l 植物生物技術(shù)導(dǎo)論(許亦農(nóng) 麻密 譯) 化學(xué)工業(yè)出版社l 肖尊安 植物生物技術(shù) 化學(xué)工業(yè)出版社教學(xué)目的和要求掌握植物組織培養(yǎng)的原理與技術(shù)了解植物組織培養(yǎng)技術(shù)在園藝生產(chǎn)與品種改良中的應(yīng)用現(xiàn)狀與前景重 點(diǎn)難 點(diǎn)l 組織培養(yǎng)技術(shù)l 組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用教學(xué)進(jìn)程（含教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)方法、 輔助手段、師生互動(dòng)、學(xué)時(shí)分配、板書設(shè)計(jì)）第一節(jié) 概說 組織培養(yǎng)(Tissue culture)指通過無菌操作分離植物體的一部分，即外植體（explants）接種到人工培養(yǎng)基（medium)，在人工控制的條件下（包括營養(yǎng)、激素、溫度、光照等）進(jìn)行培養(yǎng)，使其產(chǎn)生完整植株的過程。一 植物組織培養(yǎng)類型（一）根據(jù)培養(yǎng)方式：（二）根據(jù)培養(yǎng)過程分：（三）、根據(jù)培養(yǎng)材料分二、組織培養(yǎng)的意義園藝植物組織培養(yǎng)的意義和應(yīng)用l 加速無性或有性世代的繁殖，縮短育種周期或獲得新的基因。l 克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙，促進(jìn)幼胚發(fā)育。l 獲得三倍體。l 快速繁殖苗木具有質(zhì)量好、體積小、便于攜帶、運(yùn)輸和交流。l 獲得無病毒苗木。l 離體保存（包括超低溫）種質(zhì)資源三、組織培養(yǎng)理論與技術(shù)發(fā)展簡史　1902年，植物生理學(xué)家（德），根據(jù)細(xì)胞理論，提出：高等植物的器官和組織可以不斷分割、直至單個(gè)細(xì)胞的植物細(xì)胞全能性（totipotency）的理論。即植物的體細(xì)胞在適當(dāng)條件下，具有不斷分裂和繁殖，發(fā)展成完全植株的潛在能力。HABERLANDT2. 奠基階段3. 迅速發(fā)展階段四 技術(shù)的發(fā)展（一）材料范圍的逐步擴(kuò)大第二節(jié) 組織培養(yǎng)原理與技術(shù)l 細(xì)胞是生物有機(jī)體的基本結(jié)構(gòu)單位，特別是植物細(xì)胞又是在生理上發(fā)育上具有潛在全能性的單位。l 受精卵：可以產(chǎn)生具有完整形態(tài)和結(jié)構(gòu)和功能的植株。l 體細(xì)胞：也具備遺傳信息的傳遞、轉(zhuǎn)錄和翻譯的能力。Basis for cell culture細(xì)胞分化和形態(tài)建成1．合子胚的發(fā)育，經(jīng)歷生長和分化過程，生長為完整結(jié)構(gòu)的有機(jī)體；2．體細(xì)胞生長（類似），開始是進(jìn)行生長。從一個(gè)分化的有專一功能的細(xì)胞，要表現(xiàn)它的全能性，首先要經(jīng)過去分化（脫分化）的過程，改變細(xì)胞原來的結(jié)構(gòu)、功能，而回復(fù)到無結(jié)構(gòu)的分生組織狀態(tài)，即愈傷組織狀態(tài)。愈傷組織分生細(xì)胞團(tuán)再分化，進(jìn)行形態(tài)建成，而產(chǎn)生完整植株。（體細(xì)胞胚胎發(fā)生）最常見的再分化是根的形成：3 種方式（1）先形成根的，往往抑制芽的形成；（2）先形成芽的，較易產(chǎn)生根；（3）同時(shí)產(chǎn)生芽和根。l 一般而言，芽和莖葉原基起源于組織培養(yǎng)中比較表層的細(xì)胞（外起源）l 根原基則發(fā)生在組織較深處（內(nèi)起源）l 在組織培養(yǎng)中再生植株還可通過與合子胚相似的胚胎發(fā)生過程，即形成胚狀體，而成為完整的植株。l 有分化胚狀體能力的種子植物已有117種（分屬于34科，75屬）。胚狀體可從以下幾種培養(yǎng)物中產(chǎn)生：1．直接從器官上發(fā)生；2．從愈傷組織上發(fā)生；3．從游離的單細(xì)胞發(fā)生；4．從小孢子發(fā)生。 誘導(dǎo)胚狀體與誘導(dǎo)芽相比，有3個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)：1 數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整；2 胚狀體以單細(xì)胞直接分化成小植株，比經(jīng)過愈傷組織再分化要快；3 胚狀體一旦形成即可再生小植株，成苗率高。第二 節(jié) 實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)及基本設(shè)備一 實(shí) 驗(yàn) 室 設(shè) 置（一）基 本 實(shí) 驗(yàn) 室 準(zhǔn)備室 準(zhǔn)備室的功能就是進(jìn)行一切與實(shí)驗(yàn)有關(guān)的準(zhǔn)備工作。要求寬敞明亮，通風(fēng)條件好。 接種室 接種室的功能是進(jìn)行無菌操作。要求封閉性好，干燥清潔，能較長時(shí)間保持無菌。為了保持清潔，接種室應(yīng)防止空氣對流。 培養(yǎng)室 培養(yǎng)室的功能是對離體材料進(jìn)行控制培養(yǎng)。其首要要求是要能控制光照和溫度，其次為防止微生物感染，培養(yǎng)室應(yīng)保持干燥和清潔。（二）輔 助 實(shí) 驗(yàn) 室細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室 其功能是對培養(yǎng)材料進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定和研究。要求清潔、明亮、干燥，使各種光學(xué)儀器不受潮濕和灰塵污染。攝影室及暗室 其功能是進(jìn)行培養(yǎng)材料的攝影記錄和膠片沖印。在有條件的情況下可建立此實(shí)驗(yàn)室。生化分析室 在以培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物為主要目的的實(shí)驗(yàn)室中，應(yīng)建立相應(yīng)的分析化驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，以便于對培養(yǎng)物的有效成分隨時(shí)進(jìn)行取樣檢查。 二 培養(yǎng)容器與用具l 玻璃容器l 塑料容器l 金屬用具l 塑料用具第三節(jié) 組織培養(yǎng)基一　培養(yǎng)基的種類和成分（一）培養(yǎng)基的種類1．培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)最重要的基質(zhì)。2．培養(yǎng)基的名稱－－多數(shù)以發(fā)表人的名字命名，再加上年號。3．國際上常用的五種培養(yǎng)基：MS：Murashige 和Skoog (1962)ER：Eriksson（1965）B5：Gamborg等（1968）SH：Shenk和Hildebrandt（1972）HE：Heller（1953）l