【正文】 入酶標抗體，最后加入底物，室溫避光放置一定時間后，判斷結(jié)果A蛋白酶聯(lián)免疫吸附法（Protein A sandwich ELISA，PASELISA） ? 為一種間接法。首先用A蛋白包被微板的孔，然后加入病毒的抗體，再加入待檢樣品粗提液，經(jīng)第二層抗體與病毒結(jié)合，加入酶標記A蛋白，最后加入底物，室溫避光放置一定時間后，判斷結(jié)果。 (3)直接組織免疫雜交分析（Direct tissue blot immunoassay，DTBIA） ? 也稱組織免疫印跡ELISA（Tissue printing ELISA）分析，是ELISA的另一形式，其原理與ELISA相似，所不同的是用一種特殊的薄膜代替常規(guī)的微量板作固相支持物，酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生的是不可溶的有色物質(zhì)沉積在帶病毒的部位，觀察有色物質(zhì)即可判斷是否帶有病毒。通過組織切面在膜上產(chǎn)生印跡，將抗原直接束縛在膜上，不需要制備或提取樣品，而且可直接提供病毒在組織中的分布信息，尤其適合于韌皮部限制性病毒的檢測，具有靈敏度高、結(jié)果可靠和快速的特點，該項技術(shù)已成功應(yīng)用于柑橘速衰病毒（CTV）的檢測 （四） 核酸分析 ? 電泳分析 在類病毒的檢測中應(yīng)用廣泛 ，類病毒為環(huán)狀單鏈RNA分子 ，大小為246~375個核苷酸（nt），內(nèi)部堿基高度互補。在自然情況下形成棒狀或三葉草狀的二級結(jié)構(gòu)，在常規(guī)電泳條件下遷移較快；在變性條件下，由于二級結(jié)構(gòu)破壞而成環(huán)狀，在電泳介質(zhì)中遷移減緩，而與其它小分子物質(zhì)分開，表現(xiàn)類病毒的特有電泳條帶。因此雙向電泳也是鑒別一種病原是否為類病毒的常用技術(shù)。 ? PCR技術(shù) 病毒和類病毒的基因組成已經(jīng)明確，可以根據(jù)已知序列設(shè)計特異引物進行PCR檢測 ? 核酸雜交技術(shù) 探針第三節(jié) 園藝植物病毒脫除技術(shù)一 無病毒的培育方法? 熱處理? 莖尖培養(yǎng)脫毒? 其它組織培養(yǎng)脫毒? 莖尖微芽嫁接脫毒? 熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒? 化學治療脫毒二、熱處理脫毒? 柑橘黃龍病50℃50min 蒸氣或37℃， 3周? 柑橘衰退病40/30變溫，7－12周? 柑橘碎葉病40/30變溫，8周? 草莓斑駁病37－38 ℃， 2周? 通常，熱處理對球狀、線狀病毒、類菌質(zhì)體、類細菌體是有效的。對類病毒沒有效果。三 莖尖脫毒1．White（1943年）首先發(fā)現(xiàn)了感染煙草花葉病毒的煙草植株生長點附近病毒濃度很低；2．Morel等（1953）從感染花葉病毒的大麗菊分離出了莖尖分和組織，并得到無病毒植株。3．以后，相繼在其它植物培養(yǎng)成功，如：馬鈴薯、菊花、蘭花、百合、草莓、矮牽牛、蔦尾；四 其它方法脫毒1．愈傷組織培養(yǎng)無病毒苗：取材方便，一次可得到大量無病毒苗；2．莖尖微體嫁接培養(yǎng)：桃、柑桔、蘋果等，砧木試管培養(yǎng)，然后嫁接無病芽；3．珠心胚培養(yǎng)：柑桔類，通過珠心細胞產(chǎn)生無性胚（珠心胚），培養(yǎng)可以得到無病毒的珠心胚苗。五 莖尖微芽嫁接脫毒? 培養(yǎng)無病毒植株? 解決生根難的問題? 莖尖嫁接苗無童期的，能快開花結(jié)果。? 從1980年開始，農(nóng)業(yè)部在華中農(nóng)業(yè)大學建立了柑橘研究所，在章文才教授的主持下，仿照西班牙無病毒良種生產(chǎn)程序，率先在我國進行柑橘莖尖微芽嫁接及無病毒良種繁育技術(shù)研究，該項目1986年獲農(nóng)業(yè)部科技進步二等獎。此后后，華中農(nóng)業(yè)大學柑橘研究所為全國柑橘主產(chǎn)區(qū)培養(yǎng)了大批技術(shù)骨干。1988至1991我所與廣西農(nóng)墾局橫向聯(lián)合，培育了12個優(yōu)良柑橘品種脫毒苗200余株，為廣西省無病毒柑橘推廣起到了良好的示范作用。莖尖嫁接脫毒的原理? 莖尖微芽嫁接脫毒：根據(jù)一般病毒在植物體內(nèi)分布不均勻，頂端生長點的分生組織不帶毒或檢查不到病毒的原理，通過莖尖嫁接脫毒得到無毒苗。? 目前莖尖嫁接方法可脫去柑桔大多數(shù)病害，這一方法被世界各國普遍采用，成為獲得柑桔良種無毒植株的主要手段。? 操作方法：試管砧木苗的培養(yǎng)　　　　　　莖尖消毒和嫁接　　　　　　移栽試驗　　　　　　病毒鑒定六 幾種常見園藝病毒病及脫除（一）柑橘黃龍病病癥? 黃龍病又名黃梢病，國外稱青果病，是國內(nèi)外檢疫對象。? 過去稱之為類細菌[Bacterialike organism(BLO)]，最近國外研究證實為一種細菌又稱難培養(yǎng)細菌[Fastidious bacteria(FB)]。? 該病遠距離傳播，通過帶菌苗木和接穗的調(diào)運。從病區(qū)傳播到新區(qū)。? 田間初侵染源來自病樹，柑橘木虱是傳病的介體昆蟲。? 最感病的品種為蕉柑和蘆柑，其次為甜橙和柚，溫州蜜柑則較耐病。1 傳播媒介—木虱2 癥狀? ①斑駁型黃化，葉片呈黃綠相問的不均勻斑塊狀，這種類型最為常見，是田間診斷黃龍病的主要依據(jù)。? ②均勻黃化型，即呈均勻的淺黃色。? ③缺素型黃化，出現(xiàn)在中、晚期病樹上，葉脈及其附近呈綠色，而葉肉呈黃色，類似缺鋅、缺錳癥。患病樹葉小，質(zhì)硬，無光澤，常早落。開花多而早，花瓣短小肥厚，多個花朵聚集成團，落花落果嚴重。果實小，畸形果臍歪斜，著色不均，有的品種果蒂周圍變紅色，而其余部分仍為青色，俗稱“紅鼻果”。3 防治方法①實施檢疫，嚴禁病區(qū)苗木向新區(qū)、無病區(qū)調(diào)運。②建立無病苗圃，培育推廣無病苗木。③及時挖除病樹并集中燒毀。④防治柑橘木虱，在每次抽梢期噴藥1—2次，控制傳病蟲媒，抑制病害蔓延。 長春花苗? 接種黃龍病病原，葉片出現(xiàn)黃化斑駁。（二）柑橘衰退病? 又名速衰病，在我國分布普遍，主要為害以酸橙為砧木的嫁接樹。由于我國目前栽培的柑橘一般采用耐病的砧木，故大多植株帶病而不表現(xiàn)明顯癥狀。? 橙作砧木的甜橙苗木，一般在嫁接當年于6—7月開始顯癥，新梢部分葉片主側(cè)脈附近綠色，葉肉黃化，似缺鋅癥。? 后主側(cè)脈附近也褪綠，呈均勻黃化。黃化葉片中間常留近圓形小綠島。苗木發(fā)病后第二年黃化不顯著，但生長衰弱。嫁接口上部主干表現(xiàn)腫大、切下嫁接口交叉處的皮層，可看到病樹內(nèi)皮層上：出現(xiàn)“蜂窩”狀陷點，木質(zhì)部外表則出現(xiàn)剛毛狀小突刺。? 大樹發(fā)病常大部分大枝或個別大枝先表現(xiàn)。發(fā)病植株矮化，抽梢少或不抽梢、老葉失去光澤并出現(xiàn)不同程度的黃化。病樹逐漸落葉，自頂部向下枯梢，緩慢衰亡。有時病樹顯癥后不久即突然凋萎枯死，故稱之速衰病。指示植物墨西哥來檬、尤力克檸檬和葡萄柚上的癥狀為新長出的葉片出現(xiàn)“明脈”，莖干的木質(zhì)部出現(xiàn)凹陷點或凹陷條溝。植株矮化，葉脈木質(zhì)化，葉片黃化呈匙狀。2. 防治方法①選擇耐病砧木，如枳、酸橙、枳橙和紅桔等。②選用無病毒的繁殖材料。③防治媒介昆蟲蚜蟲。④用弱毒株系預先接種，干擾強毒株系的侵染為害。3. 病原和發(fā)病規(guī)律? 由柑橘衰退病毒(Citrus Tristeza Vlrus簡稱CTV)引起。? 遠距離傳播通過帶病苗木和嫁接材料調(diào)運，田間主要通過蚜蟲傳播。 作業(yè)布置；什么叫病毒？園藝作物病毒病發(fā)生和傳播有何特點？如何防治病毒?。繄@藝植物病毒鑒定有哪些方法？園藝作物病毒病如何脫除？課后自我總結(jié)分析內(nèi)容較多，脫毒原理與主要方法應(yīng)重點講解。注：板書設(shè)計可在授課進程中直接用橫線、浪線等標示出。華中農(nóng)業(yè)大學教案（課時備課） 第 1011 次課 4 學時課目、課題（章節(jié)）第五章 分子標記技術(shù)主要參考資料l 鄧秀新 胡春根主編 園藝植物生物技術(shù) 高等教育出版社 2005。l 植物生物技術(shù)導論(許亦農(nóng) 麻密 譯) 化學工業(yè)出版社l 張獻龍 植物生物技術(shù) 科學工業(yè)出版社，2005教學目的和要求要求同學們掌握分子標記的基本原理、主要分子標記類型，以及在園藝植物研究中的應(yīng)用。重 點難 點分子標記的主要類型和應(yīng)用；分子標記的基本原理。教學進程（含教學內(nèi)容、教學方法、 輔助手段、師生互動、學時分配、板書設(shè)計）分子標記的原理1) DNA是主要的遺傳物質(zhì)2) DNA的生物學特性3) DNA檢測技術(shù)目前常用的分子標記技術(shù)1) RFLP2) RAPD3) SSR4) AFLP分子標記在園藝植物中的應(yīng)用1) 品種鑒別與產(chǎn)權(quán)保護2) 種質(zhì)資源研究3) 分子標記輔助育種4) 構(gòu)建遺傳圖譜、基因定位與克隆重要概念：遺傳標記（Genetic markers)：是能明確反映遺傳多態(tài)性的生物特征，它包括：形態(tài)標記、細胞學標記、生化標記和分子標記遺傳多態(tài)性(Genetic polymorphisms)：經(jīng)典遺傳學中指等位基因的變異；現(xiàn)代遺傳學中指的是基因組中任何位點上的相對差異。分子標記：能明確反映遺傳多態(tài)性的外觀性狀，一般用肉眼可識別，或物理儀器便可識別的性狀。細胞學標記：能明確反映遺傳多態(tài)性的細胞學特征，染色體結(jié)構(gòu)的數(shù)目是常見的細胞學標記，它能反映染色體結(jié)構(gòu)的數(shù)目的遺傳多態(tài)性 （染色體缺失、重復、倒位、易位）。生化標記：可分為酶蛋白質(zhì)和非酶蛋白質(zhì)兩類。在非酶蛋白質(zhì)中用得最多的是種子貯藏蛋白；同工酶（isoenzyes）：催化功能相同，但結(jié)構(gòu)的生理性質(zhì)不同的一類酶。DNA標記：一切能揭示DNA多態(tài)性的技術(shù)手段；它是DNA水平上遺傳多態(tài)性的直接反映，可分為：基于DNADNA雜交的標記；基于PCR的DNA標記；PCR與雜交相結(jié)合的標記；SNP。RFLP（限制性片段長度多態(tài)性）：Restriction Fragment Length Polymorphism，物種的基因組DNA在限制性內(nèi)切酶作用下，產(chǎn)生相當多的大小不等的片段，用放射性同位素標記的DNA作探針，把與被標記DNA相關(guān)的片段檢測出來，從而構(gòu)建出多態(tài)性圖譜PCR（聚合酶鏈式反應(yīng)）：Polymerphase Chain Reaction，是在試管中模擬細胞內(nèi)的DNA復制。RAPD(隨機擴增的多態(tài)性DNA）：Random amplification of Polymorphic DNA，以 PCR 為基礎(chǔ) , 利用人工合成的約 10 b的隨機序列寡核苷酸作引物 , 以生物的基因組 DNA 為模板 , 進行 PCR 擴增 , 產(chǎn)生不連續(xù)的 DNA 產(chǎn)物 , 通過瓊脂糖凝膠電泳來檢測 DNA 序列的多態(tài)性。 RAPD 反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)可多達 40—50次 , 每次循環(huán)中 , 雙鏈 DNA 在 95℃的高溫下變性 , 解開雙螺旋成為單鏈模板 , 然后在低溫 (36 ℃) 條件下與隨機引物結(jié)合 , 在 DNA 多聚酶的作用下，按堿基互補原則沿 5‘至3’的方向把核苷酸鏈延長，完成 DNA 復制。如此反復數(shù)十次 , 可以使單一的 DNA 序列擴增 105107 倍。SSR（簡單序列重復）: Simple Sequence Repeat，又稱微衛(wèi)星DNA （microsatellite）或短的串聯(lián)重復（Short Tandem Repeat, STR)；一類由幾個核苷酸（一般15個，基序很短）為重復單位串聯(lián)而成的DNA序列。根據(jù)兩端序列的保守性設(shè)計引物進行PCR，電泳分離，染色顯帶以檢測微衛(wèi)星序列多態(tài)性。1AFLP（擴增片段長度多態(tài)性）：Amplified Fragment Length Polymorphism,對基因組DNA進行酶切，連上雙鏈人工接頭，根據(jù)接頭的核苷酸序列和酶切位點設(shè)計引物，進行選擇性擴增。將RAPD隨機性和專一性擴增巧妙結(jié)合，再選用內(nèi)切酶以達選擇的目的。作業(yè)布置課后自我總結(jié)分析學生聽起來有難度，應(yīng)結(jié)合動畫、形象的語言使學生易于理解。注：板書設(shè)計可在授課進程中直接用橫線、浪線等標示出。華中農(nóng)業(yè)大學教案（課時備課） 第 1213 次課 4 學時課目、課題（章節(jié)）第六章 基因分離與克隆主要參考資料l 鄧秀新 胡春根主編 園藝植物生物技術(shù) 高等教育出版社 2005。l 植物生物技術(shù)導論(許亦農(nóng) 麻密 譯) 化學工業(yè)出版社l 張獻龍 植物生物技術(shù) 科學工業(yè)出版社，2005教學目的和要求要求同學們掌握基因分離克隆的基本原理、主要克隆策略，以及在園藝植物改良中的應(yīng)用。重 點難 點基因分離克隆的基本原理主要克隆策略教學進程（含教學內(nèi)容、教學方法、 輔助手段、師生互動、學時分配、板書設(shè)計）基因分離策略：功能克隆法、圖位克隆法、差異表達分析法、同源序列法、轉(zhuǎn)座子標簽法、基因芯片法基因分離克隆的基本步驟：cDNA文庫的構(gòu)建：基因組DNA克?。夯蚩寺。╣ene cloning）：一系列技術(shù)的總稱，其核心技術(shù)是在體外將來自不同生物的基因與有自主復制能力的載體DNA分子通過酶切、連接等操作重新組裝成雜合分子，并使之在適當?shù)乃拗骷毎羞M行擴增，形成大量的子代DNA分子的過程。基因克隆又稱為分子克隆、基因分離、基因操作和重組DNA技術(shù)?；蚪M文庫與cDNA文庫的區(qū)別：cDNA文庫有時效性，文庫構(gòu)建時的信息是某一時空條件下的細胞總mRNA，在轉(zhuǎn)錄水平上反映該植物在某一特定發(fā)育時期、某一特定組織或器官在某種環(huán)境條件下的基因表達情況，換一種環(huán)境或發(fā)育時期其表達狀況可能就發(fā)生改變。cDNA文庫只反映加工成熟后mRNA的堿基序列結(jié)構(gòu)。cDNA中不含有核基因中的間隔序列（內(nèi)含子）及調(diào)控區(qū)。作業(yè)布置CDNA文庫與基因組文庫的區(qū)別有哪些？課后自我總結(jié)分析學生聽起來有難度，應(yīng)結(jié)合動畫、形象的語言使學生易于理解。注：板書設(shè)計可在授課進程中直接用橫線、浪線等標示出。華中農(nóng)業(yè)大學教案（課時備課） 第 1415 次課 4 學時課目、課題（章節(jié)）第七章 轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要參考資料l 鄧秀新 胡春根主編 園藝植物生物技術(shù) 高等教育出版社 2005。l 植物生物技術(shù)導論(許亦農(nóng) 麻密 譯) 化學工業(yè)出版社l 張獻龍 植物生物技術(shù) 科學工業(yè)出版社，2005教學目的和要求要求同學們掌握轉(zhuǎn)基因的主要方法及原理、外植體選擇特點、轉(zhuǎn)基因鑒定技術(shù)