【正文】 實驗手冊，2002，武漢（課題組內(nèi)部資料。六、思考題簡述PCR產(chǎn)物TA克隆的原理和步驟。五、實驗注意事項連接溫度不宜太高，連接溫度過高（28℃）可使背景增加，使重組克隆菌減少。質(zhì)粒DNA的分離 參考有關(guān)文獻。白色菌落為含有外源插入片段的轉(zhuǎn)化子，藍色是載體自連的轉(zhuǎn)化子。重組子轉(zhuǎn)化（熱激法）1）在含適當(dāng)濃度的Ampicillin的LB平板上，涂抹4 ul IPTG（200mg/ml）和40 ul xgal（20mg/ml），然后暗置30 min以上；2） ml 離心管； 3）取出感受態(tài)大腸桿菌，冰上放置凍融；4） ml 離心管，加入50 ul感受態(tài)細胞和10 ul連接反應(yīng)液，用移液槍輕輕吸打均勻，在冰上放置30 min；5）熱激：將離心管在42 ℃下水浴90秒鐘。四、實驗方法與步驟PCR擴增片段純化回收將PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，割膠，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒收集PCR擴增產(chǎn)物，具體操作步驟參考試劑盒說明書進行。TA克隆技術(shù)比其它PCR克隆方法有更高的重組效率。通過本實驗應(yīng)掌握PCR產(chǎn)物TA克隆的原理，學(xué)習(xí)PCR產(chǎn)物純化及回收，以及PCR產(chǎn)物與TA克隆載體的連接。相對于粘性末端來說，克隆具有平末端的雙鏈PCR產(chǎn)物效率較低。主要參考文獻華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室柑橘課題組。五、實驗注意事項引物設(shè)計應(yīng)具有特異性，依靠引物設(shè)計軟件進行引物設(shè)計；引物分裝成多管，不宜反復(fù)凍融多次；PCR反應(yīng)的各種成分不能遺漏，操作應(yīng)戴手套，冰上操作；根據(jù)引物的Tm值和擴增片段長度以及PCR儀的特性來設(shè)定PCR循環(huán)條件；注意分析電泳檢測PCR產(chǎn)物時出現(xiàn)拖帶或非特異性擴增帶、無DNA帶或DNA帶很弱的可能原因。按下列體系配制反應(yīng)混合液，混勻，離心5秒（注意加1滴礦物油覆蓋PCR管）。三、主要儀器及試材含有外源cDNA片段的質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)基因蘋果、番茄葉片總DNA；外源基因的特異引物及PCR儀與相關(guān)試劑。PCR技術(shù)的特異性取決于引物和模板結(jié)合的特異性。通過本實驗應(yīng)掌握PCR原理，學(xué)習(xí)PCR操作過程。實驗五 PCR技術(shù)一、實驗?zāi)康木酆厦告準椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種體外核酸擴增系統(tǒng)，是分子克隆技術(shù)中常用技術(shù)之一。主要參考文獻華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室柑橘課題組。質(zhì)粒電泳檢測一般有三條帶，分別為質(zhì)粒的超螺旋、開環(huán)、線型三種構(gòu)型。五、實驗注意事項實驗中的液氮、氯仿、EB等都是有毒物質(zhì)，操作時應(yīng)注意防護，盡量減少臺面污染。將沉淀溶于40ul 滅菌超純水或TE（含RNase A 20ug/ml），37℃水浴30min，以降解RAN，20℃保存?zhèn)溆谩Ｎ?00ul上清液（注意：不要吸到漂浮的雜質(zhì)）至另一Eppendorf管中，加入2/，混勻，室溫放置5min，4℃離心12000g 15min。加入400ul新配置的溶液II，輕柔顛倒混勻（不可劇烈震蕩），并將離心管置于冰上23min，使細胞膜裂解（溶液II為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）。，12000g離心1min，收集菌體，倒掉菌液；，再次收集菌體，盡量將菌液倒干凈。（二）實驗步驟取含有pUC18質(zhì)粒的大腸桿菌菌液于LB固體培養(yǎng)基上劃線37℃過夜培養(yǎng)。16loading buffer（上樣緩沖液）:%溴酚藍，%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。高壓滅菌15min，貯存于4℃。15TBE:Trisbase 54g，EDTANa苯酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）。配制方法：1M TrisHCl（pH ）1ml， EDTA（pH ），加ddH2O至100ml。配制方法：5M KAc300ml，加ddH2O至500ml（視冰醋酸情況，也可按6:3:1配制），貯存于4℃。配制方法：2N NaOH 1ml，10% SDS 1ml，加ddH2O至10ml，使用前臨時配制。高壓滅菌15min，貯存于4℃。溶液I: 50mM葡萄糖，25mM TrisHCl（pH ），10mM EDTA（pH ）。IPTG（200mg/ml）:1g IPTG溶于4ml去離子雙蒸水中，定容至5ml，過濾滅菌后20℃保存。高壓滅菌15min，室溫貯存。四、實驗方法與步驟（一）試劑配制:LB培養(yǎng)基:NaCl 10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，蛋白胨（Peptone）10g，瓊脂粉15g，加ddH2O至1000ml。三、主要儀器及試材含有質(zhì)粒pUC18載體的大腸桿菌菌液及離心機、移液槍、離心管及質(zhì)粒DNA提取有關(guān)試劑。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量RNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。本實驗以堿裂解法為例介紹質(zhì)粒的抽提過程，應(yīng)掌握堿裂解法抽提質(zhì)粒的原理、步驟及各試劑的作用。質(zhì)粒的分離與提取時最常用、最基本的實驗技術(shù)。實驗手冊，2002，武漢（課題組內(nèi)部資料）。六、思考題簡述DAN提取的步驟及主要試劑的作用。五、實驗注意事項實驗中的液氮、氯仿、苯酚、EB等都是危險或有毒物質(zhì)，操作時要戴手套，并在專門區(qū)域操作。高質(zhì)量的DNA要求：A260/A230； （3）向一定量的DNA中加入限制性內(nèi)切酶EcoR I至45 U/181。l TE充分溶解備用。l氯仿：異戊醇（24：1），顛倒10分鐘（方法同上），10000 –12000 rpm離心5分鐘，吸取上層液至另一離心管中，加入60 181。：向風(fēng)干后的DNA中加入500 ul 1TE，37℃水浴1530分鐘至DNA完全溶解，加5 ul 5 mg/ml Rnase，37℃水浴6小時，然后加入700 181。苯酚：氯仿：異戊醇（25∶24∶1）：重蒸酚65℃水浴溶解，在燒杯中加入80ml溫?zé)岬恼麴s水，加入少許8羥基喹啉，溶解后加入100ml重蒸酚，再加入100ml氯仿：異戊醇（24：1），加入20克Tris Base， h左右至停止攪拌后很快分層，然后裝入棕色瓶中，4℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩Ｋ?、實驗方法與步驟 : CTAB提取液：(1)100 mM TrisHCl(PH )， M NaCl，50 mM EDTA(PH )(2)1% PVP，2% CTAB(3)取少許(1)加到(2)中，攪拌成糊狀,后加(1)至足量，65℃水浴充分溶解備用。DNA電泳是依據(jù)DNA帶負電荷，而不同濃度的瓊脂糖凝膠孔徑大小不同，在外加電場的作用下DNA由負極向正極移動，分子量小的移動快而分子量大的移動慢，最終達到不同分子量大小的DNA分離的目的。在機械研磨、高溫和去污劑的共同作用下，植物細胞破裂，DNA從細胞核釋放到提取緩沖液中。通過本實驗應(yīng)了解常用DNA提取方法的原理和技術(shù)，掌握改良CTAB法提取植物DNA以及DNA檢測技術(shù)，為將來從事園藝植物生物技術(shù)研究奠定基礎(chǔ)。實驗手冊，2002，武漢（課題組內(nèi)部資料）。植物學(xué)通報,2005，22:3742。七、思考題影響植物組織培養(yǎng)的因素有哪些？主要參考文獻，曾君祉，周志勇，陳毓荃，黃華樑。外植體消毒及接種操作要規(guī)范，注意超凈臺的衛(wèi)生，養(yǎng)成良好的實驗習(xí)慣。大量元素(10倍液)ml 微量元素(100倍)ml 甘氨酸和肌醇(100倍)ml 鐵鹽（100倍）ml 維生素B（100倍）ml Vc（100倍）ml 蔗糖g 瓊脂 g（三）接種與培養(yǎng)在超凈臺上接種后，用記號筆做好標(biāo)簽，放置到光照培養(yǎng)室中進行培養(yǎng)。這樣不容易產(chǎn)生沉淀。有些試劑在乙醇或鹽酸中也可溶解，但比較而言，用堿溶解比較穩(wěn)定，不易產(chǎn)生沉淀。其它溶液配制：BA，NAA，IBA，GA3等激素類試劑可先用少量1N NaOH徹底溶解，再加水定容。注: 需要溶解完一個再加另一個；VB5不易溶解，需要攪拌，必要時可以加熱。7H2O g，分別溶解后混合定容到1L，放入棕色細口瓶中，室溫放置10 h以上（防止結(jié)晶沉淀），然后放入4℃冰箱。配制過程中產(chǎn)生沉淀的原因有：； 值過高，可加幾滴鹽酸校正。KNO395 g NH4NO3 g KH2PO g MgSO4?7H2O g CaCl2?2H2O g 注意事項：（1）配置母液前要仔細清洗存儲容器（2）應(yīng)按照順序分別徹底溶解后混合，每加完一種藥品，搖動存儲瓶使其混合均勻；（3）溶解時最好加熱，以便充分溶解，避免沉淀的產(chǎn)生；（4）夏季要用新制的蒸餾水，并加熱，這樣可以避免因為水中帶菌量過大而產(chǎn)生沉淀，同時可以減緩綠藻的生成；（5）沉淀的產(chǎn)生一是由于溶解不充分就混合造成的渾濁型沉淀，所以配置時一定不要急；二是由于長菌而產(chǎn)生絮狀沉淀，所以要用新制的蒸餾水并加熱。在適宜的培養(yǎng)條件下，植物的細胞、組織或器官都具備再生成完整植物的能力。胡蘿卜以其培養(yǎng)體系成熟、再生容易而被視為組織培養(yǎng)的理想外植體材料，本實驗通過胡蘿卜的組織培養(yǎng)使同學(xué)們掌握基本培養(yǎng)基的配制、滅菌及培養(yǎng)的基本技能。五、思考題根據(jù)參觀內(nèi)容，描述本次參觀有了解到的主要儀器的名稱、用途及使用中的注意事項。每班分為兩小組簡要介紹現(xiàn)代生物技術(shù)實驗室的布局及功能分區(qū)情況；針對每個分區(qū)的重要儀器進行講述，結(jié)束時對所有參觀內(nèi)容進行簡要總結(jié)，并回答同學(xué)們的提問。二、實驗場所選擇及實驗內(nèi)容園藝學(xué)院植物分子生物技術(shù)實驗室與開展現(xiàn)代生物技術(shù)研究直接相關(guān)的實驗室分工與布局和主要相關(guān)儀器：如與組織培養(yǎng)有關(guān)的超凈工作臺、高壓滅菌鍋、接種至、培養(yǎng)室等；與分子生物學(xué)有關(guān)的高速冷凍離心機、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)等。第五篇：《園藝植物生物技術(shù)》實驗教案《園藝植物生物技術(shù)》實驗教案實驗一 現(xiàn)代生物技術(shù)實驗室與實驗儀器一、實驗?zāi)康膶嶒炇液蛯嶒瀮x器是開展現(xiàn)代生物技術(shù)研究的基礎(chǔ)平臺，對實驗室布局和儀器配置的掌握程度是學(xué)生知識結(jié)構(gòu)完整性的重要體現(xiàn)。、如果現(xiàn)已證明園藝植物的某一重要農(nóng)藝性狀是單基因控制的質(zhì)量性狀，且發(fā)現(xiàn)了一個與控制該性狀的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。？，現(xiàn)欲建一園藝植物組織培養(yǎng)實驗室，請簡述實驗室的布局及主要的儀器設(shè)備六、綜述題：將下列各題的答案寫在下面的方框內(nèi)。，滅菌時間。Ant D:GFP ：（）A：抗生素基因 B：NPTⅡ基因 C：花青素基因 D：熒光素酶基因：（）Ａ：誘導(dǎo)莖細胞的伸長 Ｂ：對形成層的細胞分化有影響 Ｃ：可以解除種子、塊莖、鱗莖等休眠 Ｄ：抑制衰老：（）A：同源序列法 B：圖位克隆法 C：功能克隆法 D：差減雜交法五、簡答題：將下列各題的答案填在下面的方框內(nèi)。四、選擇題：從備選答案中選出正確的結(jié)果，正確答案是唯一的。、＿、＿等四種。______標(biāo)記。 aquaticus 菌提取的熱穩(wěn)定性酶，、＿、＿等。，已在獼猴桃、馬鈴薯、苜蓿、萵苣、甘藍、蕃茄、柑橘等植物的原生質(zhì)體再生植株中觀察到變異，再生植株產(chǎn)生的變異主要有＿、＿、＿、＿。獲得單倍體的方法有三種＿、＿、＿。，如果實驗很成功，且檢測方法正確，則下列基因的作用效果應(yīng)呈現(xiàn)的顏色分別是：LacZ基因重組子_____色菌斑；GUS呈______色；GFP呈_______色。、＿、＿、＿等方法。、基因槍介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化、花粉管通道法、無選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。，通過觀察特異性條帶而對這些病原進行鑒定。：大腸桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、電擊法介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、基因槍法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化及花粉管通道法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化等。，而花粉培養(yǎng)則屬于器官培養(yǎng)的范疇。，往往不能進行高壓滅菌，通常采用過濾滅菌，即先將除去了這些不耐熱物質(zhì)的培養(yǎng)基的其他成份經(jīng)高壓滅菌后放置于無菌場所，若制備半固態(tài)培養(yǎng)基，須待培養(yǎng)基冷卻至60℃左右，再加入經(jīng)過濾滅菌的各種不耐熱成分溶液，再混勻放置，分裝備用。：能在宿主細胞中能自我自制并能穩(wěn)定保存，要有多個酶切位點，每種酶切位點最好只有一個，酶切后不損壞其自制能力及選擇標(biāo)記基因并能嵌于外源DNA具有可作為選擇。，常采用酶解的方法脫除細胞壁。一、將下面詞組相對應(yīng)的中文譯成拉丁文或拉丁文譯成中文。、如果現(xiàn)已證明園藝植物的某一重要農(nóng)藝性狀是單基因控制的質(zhì)量性狀，且發(fā)現(xiàn)了一個與控制該性狀的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。六、綜述題：將下列各題的答案寫在下面的方框內(nèi)。？。Ant D:GFP：（）A：免疫注射 B：細胞融合 C：篩選 D：克隆化：（）Ａ：準備室 Ｂ：制備室 Ｃ：無菌操作室 Ｄ：培養(yǎng)室:()A：有性雜交 B：體細胞雜交 C：組織培養(yǎng) D：基因克?。海ǎ粒悍N質(zhì)資源保存 Ｂ：原生質(zhì)體融合 Ｃ：篩選突變體 Ｄ：遺傳轉(zhuǎn)化：（）A：對稱融合 B：非對稱融合 C：配子—體細胞融合 D：：（）A：兩側(cè)的引物 B：DNA模板 C：TaqDNA聚合酶 D：Mg+ :（