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植物生物技術(存儲版)

2024-10-13 20:41上一頁面

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【正文】 置于無菌場所,若制備半固態(tài)培養(yǎng)基,須待培養(yǎng)基冷卻至60℃左右,再加入經(jīng)過濾滅菌的各種不耐熱成分溶液,再混勻放置,分裝備用。,通過觀察特異性條帶而對這些病原進行鑒定。,如果實驗很成功,且檢測方法正確,則下列基因的作用效果應呈現(xiàn)的顏色分別是:LacZ基因重組子_____色菌斑;GUS呈______色;GFP呈_______色。______標記。,滅菌時間。二、實驗場所選擇及實驗內(nèi)容園藝學院植物分子生物技術實驗室與開展現(xiàn)代生物技術研究直接相關的實驗室分工與布局和主要相關儀器:如與組織培養(yǎng)有關的超凈工作臺、高壓滅菌鍋、接種至、培養(yǎng)室等;與分子生物學有關的高速冷凍離心機、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)等。在適宜的培養(yǎng)條件下,植物的細胞、組織或器官都具備再生成完整植物的能力。注: 需要溶解完一個再加另一個;VB5不易溶解,需要攪拌,必要時可以加熱。大量元素(10倍液)ml 微量元素(100倍)ml 甘氨酸和肌醇(100倍)ml 鐵鹽(100倍)ml 維生素B(100倍)ml Vc(100倍)ml 蔗糖g 瓊脂 g(三)接種與培養(yǎng)在超凈臺上接種后,用記號筆做好標簽,放置到光照培養(yǎng)室中進行培養(yǎng)。實驗手冊,2002,武漢(課題組內(nèi)部資料)。四、實驗方法與步驟 : CTAB提取液:(1)100 mM TrisHCl(PH ), M NaCl,50 mM EDTA(PH )(2)1% PVP,2% CTAB(3)取少許(1)加到(2)中,攪拌成糊狀,后加(1)至足量,65℃水浴充分溶解備用。l TE充分溶解備用。實驗手冊,2002,武漢(課題組內(nèi)部資料)。三、主要儀器及試材含有質(zhì)粒pUC18載體的大腸桿菌菌液及離心機、移液槍、離心管及質(zhì)粒DNA提取有關試劑。溶液I: 50mM葡萄糖,25mM TrisHCl(pH ),10mM EDTA(pH )。配制方法:1M TrisHCl(pH )1ml, EDTA(pH ),加ddH2O至100ml。16loading buffer(上樣緩沖液):%溴酚藍,%二甲苯青FF,40%(W/V)蔗糖水溶液。吸取800ul上清液(注意:不要吸到漂浮的雜質(zhì))至另一Eppendorf管中,加入2/,混勻,室溫放置5min,4℃離心12000g 15min。主要參考文獻華中農(nóng)業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室柑橘課題組。三、主要儀器及試材含有外源cDNA片段的質(zhì)?;蜣D基因蘋果、番茄葉片總DNA;外源基因的特異引物及PCR儀與相關試劑。相對于粘性末端來說,克隆具有平末端的雙鏈PCR產(chǎn)物效率較低。重組子轉化(熱激法)1)在含適當濃度的Ampicillin的LB平板上,涂抹4 ul IPTG(200mg/ml)和40 ul xgal(20mg/ml),然后暗置30 min以上;2) ml 離心管; 3)取出感受態(tài)大腸桿菌,冰上放置凍融;4) ml 離心管,加入50 ul感受態(tài)細胞和10 ul連接反應液,用移液槍輕輕吸打均勻,在冰上放置30 min;5)熱激:將離心管在42 ℃下水浴90秒鐘。六、思考題簡述PCR產(chǎn)物TA克隆的原理和步驟。五、實驗注意事項連接溫度不宜太高,連接溫度過高(28℃)可使背景增加,使重組克隆菌減少。四、實驗方法與步驟PCR擴增片段純化回收將PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,割膠,利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒收集PCR擴增產(chǎn)物,具體操作步驟參考試劑盒說明書進行。主要參考文獻華中農(nóng)業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室柑橘課題組。PCR技術的特異性取決于引物和模板結合的特異性。質(zhì)粒電泳檢測一般有三條帶,分別為質(zhì)粒的超螺旋、開環(huán)、線型三種構型。加入400ul新配置的溶液II,輕柔顛倒混勻(不可劇烈震蕩),并將離心管置于冰上23min,使細胞膜裂解(溶液II為裂解液,故離心管中菌液逐漸變清)。高壓滅菌15min,貯存于4℃。配制方法:5M KAc300ml,加ddH2O至500ml(視冰醋酸情況,也可按6:3:1配制),貯存于4℃。IPTG(200mg/ml):1g IPTG溶于4ml去離子雙蒸水中,定容至5ml,過濾滅菌后20℃保存。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下,大部分染色體DNA、大分子量RNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀,而質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。六、思考題簡述DAN提取的步驟及主要試劑的作用。l氯仿:異戊醇(24:1),顛倒10分鐘(方法同上),10000 –12000 rpm離心5分鐘,吸取上層液至另一離心管中,加入60 181。DNA電泳是依據(jù)DNA帶負電荷,而不同濃度的瓊脂糖凝膠孔徑大小不同,在外加電場的作用下DNA由負極向正極移動,分子量小的移動快而分子量大的移動慢,最終達到不同分子量大小的DNA分離的目的。植物學通報,2005,22:3742。這樣不容易產(chǎn)生沉淀。7H2O g,分別溶解后混合定容到1L,放入棕色細口瓶中,室溫放置10 h以上(防止結晶沉淀),然后放入4℃冰箱。胡蘿卜以其培養(yǎng)體系成熟、再生容易而被視為組織培養(yǎng)的理想外植體材料,本實驗通過胡蘿卜的組織培養(yǎng)使同學們掌握基本培養(yǎng)基的配制、滅菌及培養(yǎng)的基本技能。第五篇:《園藝植物生物技術》實驗教案《園藝植物生物技術》實驗教案實驗一 現(xiàn)代生物技術實驗室與實驗儀器一、實驗目的實驗室和實驗儀器是開展現(xiàn)代生物技術研究的基礎平臺,對實驗室布局和儀器配置的掌握程度是學生知識結構完整性的重要體現(xiàn)。Ant D:GFP :()A:抗生素基因 B:NPTⅡ基因 C:花青素基因 D:熒光素酶基因:()A:誘導莖細胞的伸長 B:對形成層的細胞分化有影響 C:可以解除種子、塊莖、鱗莖等休眠 D:抑制衰老:()A:同源序列法 B:圖位克隆法 C:功能克隆法 D:差減雜交法五、簡答題:將下列各題的答案填在下面的方框內(nèi)。 aquaticus 菌提取的熱穩(wěn)定性酶,、_、_等。、_、_、_等方法。:大腸桿菌介導的轉化,PEG介導基因轉化、電擊法介導的轉化、基因槍法介導基因轉化及花粉管通道法介導基因轉化等。:能在宿主細胞中能自我自制并能穩(wěn)定保存,要有多個酶切位點,每種酶切位點最好只有一個,酶切后不損壞其自制能力及選擇標記基因并能嵌于外源DNA具有可作為選擇。六、綜述題:將下列各題的答案寫在下面的方框內(nèi)。四、選擇題:從備選答案中選出正確的結果,正確答案是唯一的。,在園藝植物病毒病的防治中常用的策略主要有_、_、_、_。三、填空題:將下列各題空缺部分的答案填在后面的方框內(nèi),兩者用“,”隔開。,新合成鏈的延伸方向是從5’到3’方向。 hybridization二、判斷下列各題正確與否,正確的填“Y”錯誤的填“N”。,現(xiàn)欲建一園藝植物組織培養(yǎng)實驗室,請簡述實驗室的布局及主要的儀器設備,滅菌時間。,已在獼猴桃、馬鈴薯、苜蓿、萵苣、甘藍、蕃茄、柑橘等植物的原生質(zhì)體再生植株中觀察到變異,再生植株產(chǎn)生的變異主要有_、_、_、_。,主要有_、_、_。:能在宿主細胞中能自我自制并能穩(wěn)定保存,要有多個酶切位點,每種酶切位點最好只有一個,酶切后不損壞其自制能力及選擇標記基因并能嵌于外源DNA具有可作為選擇。,新合成鏈的延伸方向是從5’到3’方向。五、實驗注意事項引物設計應具有特異性,依靠引物設計軟件進行引物設計;引物分裝成多管,不宜反復凍融多次;PCR反應的各種成分不能遺漏,操作應戴手套,冰上操作;根據(jù)引物的Tm值和擴增片段長度以及PCR儀的特性來設定PCR循環(huán)條件;注意分析電泳檢測PCR產(chǎn)物時出現(xiàn)拖帶或非特異性擴增帶、無DNA帶或DNA帶很弱的可能原因。通過本實驗應掌握PCR原理,學習PCR操作過程。將沉淀溶于40ul 滅菌超純水或TE(含RNase A 20ug/ml),37℃水浴30min,以降解RAN,20℃保存?zhèn)溆?。(二)實驗步驟取含有pUC18質(zhì)粒的大腸桿菌菌液于LB固體培養(yǎng)基上劃線37℃過夜培養(yǎng)。苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)。高壓滅菌15min,貯存于4℃。四、實驗方法與步驟(一)試劑配制:LB培養(yǎng)基:NaCl 10g,酵母提取物(Yeast extract)5g,蛋白胨(Peptone)10g,瓊脂粉15g,加ddH2O至1000ml。質(zhì)粒的分離與提取時最常用、最基本的實驗技術。第三篇:《園藝植物生物技術》實驗教案實驗一 現(xiàn)代生物技術實驗室與實驗儀器一、實驗目的實驗室和實驗儀器是開展現(xiàn)代生物技術研究的基礎平臺,對實驗室布局和儀器配置的掌握程度是學生知識結構完整性的重要體現(xiàn)。(2)醫(yī)藥研究,為人類健康服務:轉基因技術可以把植物作為“生物反應器”,進行藥物蛋白、工業(yè)用酶、糖類、脂類等一些有益次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn),具有成本低、周期短、效益高和安全性好的特點。主要過程為:①提取基因組DNA;②根據(jù)已知基因保守區(qū)域的核酸序列特征,運用軟件設計引物并合成;③以基因組DNA為模板進行PCR擴增;④回收PCR擴增的目的片段;⑤將目的片段鏈接載體并轉化大腸桿菌;⑥測序并進行序列分析。③Tm值:引物的Tm值一般控制在5565℃,盡可能保證上下游引物的Tm值一致。在高離子強度的溶液中,CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復合物,但不能沉淀核酸,通過有機溶劑抽提,去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。⑤末端脫氧核糖核酸轉移酶:將脫氧核糖核酸加到DNA的3末端。二.選擇題 三.簡答題。2.RTPCR:一是反轉錄PCR的縮寫,即通過聚合酶鏈式反應,將RNA鏈逆轉錄成互補DNA,再以此為模板通過PCR進行DNA擴增。1995 年發(fā)現(xiàn)美國國際先鋒公司轉巴西堅如果基因的大豆能引起人過敏,在轉花生基因的作物中也有過過敏現(xiàn)象。為此,歐盟已經(jīng)做出了初步?jīng)Q定、禁止該轉基因玉米的種子銷售使用。如:1999年,美國康奈爾大學的研究者約翰?洛希在英國《自然》雜志上發(fā)表報告,用涂有轉Bt基因玉米花粉的葉片喂養(yǎng)斑蝶,導致44%的幼蟲死亡。植入不同的基因片段,可使食品的外觀、味道、口感甚至營養(yǎng)成分完全改變,將使人類的食物進入一個隨心所欲的新時期。轉基因技術的發(fā)展,為人們帶來了新的福音,但新的問題也隨之涌現(xiàn),對于轉基因技術走進生活這一事件,質(zhì)疑聲不絕于耳。20世紀80年代末轉基因植物在美國問世至今,該項技術正以日新月異的速度迅猛發(fā)展,逐漸走入了人們的生活。轉基因技術的理論基礎來源于分子生物學。但是在過去的幾千年內(nèi)我們的祖先對農(nóng)作物遺傳基因的改良就一直不斷的突破著和改良著,那時轉基因的方式主要是對農(nóng)作物在自然條件下突變產(chǎn)生的優(yōu)良基因和重組體的農(nóng)作物的選擇和利用,通過人為的和自然的方式來積累優(yōu)良遺傳基因。從利的方面來說轉基因技術對人類有百利而無一害。第三,增強抗逆性。2005年的11月16日,澳大利亞聯(lián)邦科學與工業(yè)研究組織(CSIRO)發(fā)表的一篇研究報告顯示,一項持續(xù)4個星期的實驗表明,被喂食了轉基因豌豆的小白鼠的肺部產(chǎn)生了炎癥,小白鼠發(fā)生過敏反應,并對其他過敏源更加敏感,并據(jù)此叫停了歷時10年、耗資300萬美元的轉基因項目。2010年4月16日,俄羅斯科學家公布了新的獨立研究成果,進一步證明倉鼠食用轉基因大豆三代就會絕種!同時轉基因技術的發(fā)展打破了自然發(fā)展的規(guī)律,或多或少破壞了生物界領域的和諧。然而,它的發(fā)展總會伴隨著各種利弊問題。4.AFLP:擴增片段長度多態(tài)性。答:SSR即微衛(wèi)星DNA又叫簡單重復序列,指的是基因組中由1~6個核苷酸組成的基本單位重復多次構成的一段DNA。③ 水浴后取出離心管冷卻至室溫,加入等體積的氯仿:異戊醇(24﹕1)混合液,輕輕上下顛倒混勻,室溫下靜置15min后,于10000 r/min離心3min,取上清液。⑤堿基的隨機分布:引物中四種堿基的分布最好是隨機的,不存在聚嘌呤和聚嘧啶,尤其在引物的3’端不應超過3個連續(xù)的G或C。目前,轉基因技術已經(jīng)成熟,轉基因作物已進入產(chǎn)業(yè)化階段,而且種植面積逐年擴大,呈直線上升趨勢??共?、抗蟲轉基因作物的廣泛種植,可以減少農(nóng)藥的使用量。三、實驗方法與步驟相關背景知識回顧:對課堂講述的各種生物技術如分子標記、細胞和組織培養(yǎng)等操作過程進行回顧,重要指出每個環(huán)節(jié)要用到的必備儀器的作用、性能指標、操作注意事項及儀器選購中應注意的問題等。二、實驗原理 在pH ,細菌的線性大分子量染色體DNA變性分開,而共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雖然變性但仍處于拓撲纏繞狀態(tài)。Xgal(20mg/ml):20mg Xgal溶于1ml二甲基甲酰胺中,20℃避光保存。溶液III:醋酸鉀(KAc)緩沖液,pH 。2H2O ,加ddH2O至1000ml。加入200ul預冷的溶液I,重新懸浮細胞,震蕩混勻(注意:應徹底混勻沉淀或碎
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