【正文】 置于無菌場(chǎng)所，若制備半固態(tài)培養(yǎng)基，須待培養(yǎng)基冷卻至60℃左右，再加入經(jīng)過濾滅菌的各種不耐熱成分溶液，再混勻放置，分裝備用。，通過觀察特異性條帶而對(duì)這些病原進(jìn)行鑒定。，如果實(shí)驗(yàn)很成功，且檢測(cè)方法正確，則下列基因的作用效果應(yīng)呈現(xiàn)的顏色分別是：LacZ基因重組子_____色菌斑；GUS呈______色；GFP呈_______色。______標(biāo)記。，滅菌時(shí)間。二、實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所選擇及實(shí)驗(yàn)內(nèi)容園藝學(xué)院植物分子生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室與開展現(xiàn)代生物技術(shù)研究直接相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室分工與布局和主要相關(guān)儀器：如與組織培養(yǎng)有關(guān)的超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、接種至、培養(yǎng)室等；與分子生物學(xué)有關(guān)的高速冷凍離心機(jī)、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)等。在適宜的培養(yǎng)條件下，植物的細(xì)胞、組織或器官都具備再生成完整植物的能力。注: 需要溶解完一個(gè)再加另一個(gè)；VB5不易溶解，需要攪拌，必要時(shí)可以加熱。大量元素(10倍液)ml 微量元素(100倍)ml 甘氨酸和肌醇(100倍)ml 鐵鹽（100倍）ml 維生素B（100倍）ml Vc（100倍）ml 蔗糖g 瓊脂 g（三）接種與培養(yǎng)在超凈臺(tái)上接種后，用記號(hào)筆做好標(biāo)簽，放置到光照培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，2002，武漢（課題組內(nèi)部資料）。四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟 : CTAB提取液：(1)100 mM TrisHCl(PH )， M NaCl，50 mM EDTA(PH )(2)1% PVP，2% CTAB(3)取少許(1)加到(2)中，攪拌成糊狀,后加(1)至足量，65℃水浴充分溶解備用。l TE充分溶解備用。實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，2002，武漢（課題組內(nèi)部資料）。三、主要儀器及試材含有質(zhì)粒pUC18載體的大腸桿菌菌液及離心機(jī)、移液槍、離心管及質(zhì)粒DNA提取有關(guān)試劑。溶液I: 50mM葡萄糖，25mM TrisHCl（pH ），10mM EDTA（pH ）。配制方法：1M TrisHCl（pH ）1ml， EDTA（pH ），加ddH2O至100ml。16loading buffer（上樣緩沖液）:%溴酚藍(lán)，%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。吸取800ul上清液（注意：不要吸到漂浮的雜質(zhì)）至另一Eppendorf管中，加入2/，混勻，室溫放置5min，4℃離心12000g 15min。主要參考文獻(xiàn)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室柑橘課題組。三、主要儀器及試材含有外源cDNA片段的質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)基因蘋果、番茄葉片總DNA；外源基因的特異引物及PCR儀與相關(guān)試劑。相對(duì)于粘性末端來說，克隆具有平末端的雙鏈PCR產(chǎn)物效率較低。重組子轉(zhuǎn)化（熱激法）1）在含適當(dāng)濃度的Ampicillin的LB平板上，涂抹4 ul IPTG（200mg/ml）和40 ul xgal（20mg/ml），然后暗置30 min以上；2） ml 離心管； 3）取出感受態(tài)大腸桿菌，冰上放置凍融；4） ml 離心管，加入50 ul感受態(tài)細(xì)胞和10 ul連接反應(yīng)液，用移液槍輕輕吸打均勻，在冰上放置30 min；5）熱激：將離心管在42 ℃下水浴90秒鐘。六、思考題簡(jiǎn)述PCR產(chǎn)物TA克隆的原理和步驟。五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)連接溫度不宜太高，連接溫度過高（28℃）可使背景增加，使重組克隆菌減少。四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟PCR擴(kuò)增片段純化回收將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，割膠，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒收集PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，具體操作步驟參考試劑盒說明書進(jìn)行。主要參考文獻(xiàn)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室柑橘課題組。PCR技術(shù)的特異性取決于引物和模板結(jié)合的特異性。質(zhì)粒電泳檢測(cè)一般有三條帶，分別為質(zhì)粒的超螺旋、開環(huán)、線型三種構(gòu)型。加入400ul新配置的溶液II，輕柔顛倒混勻（不可劇烈震蕩），并將離心管置于冰上23min，使細(xì)胞膜裂解（溶液II為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）。高壓滅菌15min，貯存于4℃。配制方法：5M KAc300ml，加ddH2O至500ml（視冰醋酸情況，也可按6:3:1配制），貯存于4℃。IPTG（200mg/ml）:1g IPTG溶于4ml去離子雙蒸水中，定容至5ml，過濾滅菌后20℃保存。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量RNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。六、思考題簡(jiǎn)述DAN提取的步驟及主要試劑的作用。l氯仿：異戊醇（24：1），顛倒10分鐘（方法同上），10000 –12000 rpm離心5分鐘，吸取上層液至另一離心管中，加入60 181。DNA電泳是依據(jù)DNA帶負(fù)電荷，而不同濃度的瓊脂糖凝膠孔徑大小不同，在外加電場(chǎng)的作用下DNA由負(fù)極向正極移動(dòng)，分子量小的移動(dòng)快而分子量大的移動(dòng)慢，最終達(dá)到不同分子量大小的DNA分離的目的。植物學(xué)通報(bào),2005，22:3742。這樣不容易產(chǎn)生沉淀。7H2O g，分別溶解后混合定容到1L，放入棕色細(xì)口瓶中，室溫放置10 h以上（防止結(jié)晶沉淀），然后放入4℃冰箱。胡蘿卜以其培養(yǎng)體系成熟、再生容易而被視為組織培養(yǎng)的理想外植體材料，本實(shí)驗(yàn)通過胡蘿卜的組織培養(yǎng)使同學(xué)們掌握基本培養(yǎng)基的配制、滅菌及培養(yǎng)的基本技能。第五篇：《園藝植物生物技術(shù)》實(shí)驗(yàn)教案《園藝植物生物技術(shù)》實(shí)驗(yàn)教案實(shí)驗(yàn)一 現(xiàn)代生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室與實(shí)驗(yàn)儀器一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)室和實(shí)驗(yàn)儀器是開展現(xiàn)代生物技術(shù)研究的基礎(chǔ)平臺(tái)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室布局和儀器配置的掌握程度是學(xué)生知識(shí)結(jié)構(gòu)完整性的重要體現(xiàn)。Ant D:GFP ：（）A：抗生素基因 B：NPTⅡ基因 C：花青素基因 D：熒光素酶基因：（）Ａ：誘導(dǎo)莖細(xì)胞的伸長(zhǎng) Ｂ：對(duì)形成層的細(xì)胞分化有影響 Ｃ：可以解除種子、塊莖、鱗莖等休眠 Ｄ：抑制衰老：（）A：同源序列法 B：圖位克隆法 C：功能克隆法 D：差減雜交法五、簡(jiǎn)答題：將下列各題的答案填在下面的方框內(nèi)。 aquaticus 菌提取的熱穩(wěn)定性酶，、＿、＿等。、＿、＿、＿等方法。：大腸桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、電擊法介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、基因槍法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化及花粉管通道法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化等。：能在宿主細(xì)胞中能自我自制并能穩(wěn)定保存，要有多個(gè)酶切位點(diǎn)，每種酶切位點(diǎn)最好只有一個(gè)，酶切后不損壞其自制能力及選擇標(biāo)記基因并能嵌于外源DNA具有可作為選擇。六、綜述題：將下列各題的答案寫在下面的方框內(nèi)。四、選擇題：從備選答案中選出正確的結(jié)果，正確答案是唯一的。，在園藝植物病毒病的防治中常用的策略主要有＿、＿、＿、＿。三、填空題：將下列各題空缺部分的答案填在后面的方框內(nèi)，兩者用“，”隔開。，新合成鏈的延伸方向是從5’到3’方向。 hybridization二、判斷下列各題正確與否，正確的填“Y”錯(cuò)誤的填“N”。，現(xiàn)欲建一園藝植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，請(qǐng)簡(jiǎn)述實(shí)驗(yàn)室的布局及主要的儀器設(shè)備，滅菌時(shí)間。，已在獼猴桃、馬鈴薯、苜蓿、萵苣、甘藍(lán)、蕃茄、柑橘等植物的原生質(zhì)體再生植株中觀察到變異，再生植株產(chǎn)生的變異主要有＿、＿、＿、＿。，主要有＿、＿、＿。：能在宿主細(xì)胞中能自我自制并能穩(wěn)定保存，要有多個(gè)酶切位點(diǎn)，每種酶切位點(diǎn)最好只有一個(gè)，酶切后不損壞其自制能力及選擇標(biāo)記基因并能嵌于外源DNA具有可作為選擇。，新合成鏈的延伸方向是從5’到3’方向。五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)引物設(shè)計(jì)應(yīng)具有特異性，依靠引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)；引物分裝成多管，不宜反復(fù)凍融多次；PCR反應(yīng)的各種成分不能遺漏，操作應(yīng)戴手套，冰上操作；根據(jù)引物的Tm值和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度以及PCR儀的特性來設(shè)定PCR循環(huán)條件；注意分析電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物時(shí)出現(xiàn)拖帶或非特異性擴(kuò)增帶、無DNA帶或DNA帶很弱的可能原因。通過本實(shí)驗(yàn)應(yīng)掌握PCR原理，學(xué)習(xí)PCR操作過程。將沉淀溶于40ul 滅菌超純水或TE（含RNase A 20ug/ml），37℃水浴30min，以降解RAN，20℃保存?zhèn)溆?。（二）?shí)驗(yàn)步驟取含有pUC18質(zhì)粒的大腸桿菌菌液于LB固體培養(yǎng)基上劃線37℃過夜培養(yǎng)。苯酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）。高壓滅菌15min，貯存于4℃。四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟（一）試劑配制:LB培養(yǎng)基:NaCl 10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，蛋白胨（Peptone）10g，瓊脂粉15g，加ddH2O至1000ml。質(zhì)粒的分離與提取時(shí)最常用、最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。第三篇：《園藝植物生物技術(shù)》實(shí)驗(yàn)教案實(shí)驗(yàn)一 現(xiàn)代生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室與實(shí)驗(yàn)儀器一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)室和實(shí)驗(yàn)儀器是開展現(xiàn)代生物技術(shù)研究的基礎(chǔ)平臺(tái)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室布局和儀器配置的掌握程度是學(xué)生知識(shí)結(jié)構(gòu)完整性的重要體現(xiàn)。（2）醫(yī)藥研究，為人類健康服務(wù)：轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以把植物作為“生物反應(yīng)器”，進(jìn)行藥物蛋白、工業(yè)用酶、糖類、脂類等一些有益次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，具有成本低、周期短、效益高和安全性好的特點(diǎn)。主要過程為：①提取基因組DNA；②根據(jù)已知基因保守區(qū)域的核酸序列特征，運(yùn)用軟件設(shè)計(jì)引物并合成；③以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；④回收PCR擴(kuò)增的目的片段；⑤將目的片段鏈接載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌；⑥測(cè)序并進(jìn)行序列分析。③Tm值：引物的Tm值一般控制在5565℃，盡可能保證上下游引物的Tm值一致。在高離子強(qiáng)度的溶液中，CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，但不能沉淀核酸，通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。⑤末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶：將脫氧核糖核酸加到DNA的3末端。二．選擇題 三．簡(jiǎn)答題。2．RTPCR：一是反轉(zhuǎn)錄PCR的縮寫，即通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，將RNA鏈逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA，再以此為模板通過PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增。1995 年發(fā)現(xiàn)美國國際先鋒公司轉(zhuǎn)巴西堅(jiān)如果基因的大豆能引起人過敏，在轉(zhuǎn)花生基因的作物中也有過過敏現(xiàn)象。為此，歐盟已經(jīng)做出了初步?jīng)Q定、禁止該轉(zhuǎn)基因玉米的種子銷售使用。如：1999年，美國康奈爾大學(xué)的研究者約翰?洛希在英國《自然》雜志上發(fā)表報(bào)告，用涂有轉(zhuǎn)Bt基因玉米花粉的葉片喂養(yǎng)斑蝶，導(dǎo)致44%的幼蟲死亡。植入不同的基因片段，可使食品的外觀、味道、口感甚至營(yíng)養(yǎng)成分完全改變，將使人類的食物進(jìn)入一個(gè)隨心所欲的新時(shí)期。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，為人們帶來了新的福音，但新的問題也隨之涌現(xiàn)，對(duì)于轉(zhuǎn)基因技術(shù)走進(jìn)生活這一事件，質(zhì)疑聲不絕于耳。20世紀(jì)80年代末轉(zhuǎn)基因植物在美國問世至今，該項(xiàng)技術(shù)正以日新月異的速度迅猛發(fā)展，逐漸走入了人們的生活。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的理論基礎(chǔ)來源于分子生物學(xué)。但是在過去的幾千年內(nèi)我們的祖先對(duì)農(nóng)作物遺傳基因的改良就一直不斷的突破著和改良著，那時(shí)轉(zhuǎn)基因的方式主要是對(duì)農(nóng)作物在自然條件下突變產(chǎn)生的優(yōu)良基因和重組體的農(nóng)作物的選擇和利用，通過人為的和自然的方式來積累優(yōu)良遺傳基因。從利的方面來說轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)人類有百利而無一害。第三，增強(qiáng)抗逆性。2005年的11月16日，澳大利亞聯(lián)邦科學(xué)與工業(yè)研究組織（CSIRO）發(fā)表的一篇研究報(bào)告顯示，一項(xiàng)持續(xù)4個(gè)星期的實(shí)驗(yàn)表明，被喂食了轉(zhuǎn)基因豌豆的小白鼠的肺部產(chǎn)生了炎癥，小白鼠發(fā)生過敏反應(yīng)，并對(duì)其他過敏源更加敏感，并據(jù)此叫停了歷時(shí)10年、耗資300萬美元的轉(zhuǎn)基因項(xiàng)目。2010年4月16日，俄羅斯科學(xué)家公布了新的獨(dú)立研究成果，進(jìn)一步證明倉鼠食用轉(zhuǎn)基因大豆三代就會(huì)絕種！同時(shí)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展打破了自然發(fā)展的規(guī)律，或多或少破壞了生物界領(lǐng)域的和諧。然而,它的發(fā)展總會(huì)伴隨著各種利弊問題。4．AFLP：擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性。答：SSR即微衛(wèi)星DNA又叫簡(jiǎn)單重復(fù)序列，指的是基因組中由1～6個(gè)核苷酸組成的基本單位重復(fù)多次構(gòu)成的一段DNA。③ 水浴后取出離心管冷卻至室溫，加入等體積的氯仿：異戊醇(24﹕1)混合液，輕輕上下顛倒混勻，室溫下靜置15min后，于10000 r/min離心3min，取上清液。⑤堿基的隨機(jī)分布：引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不存在聚嘌呤和聚嘧啶，尤其在引物的3’端不應(yīng)超過3個(gè)連續(xù)的G或C。目前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)成熟，轉(zhuǎn)基因作物已進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化階段，而且種植面積逐年擴(kuò)大，呈直線上升趨勢(shì)?？共?、抗蟲轉(zhuǎn)基因作物的廣泛種植，可以減少農(nóng)藥的使用量。三、實(shí)驗(yàn)方法與步驟相關(guān)背景知識(shí)回顧：對(duì)課堂講述的各種生物技術(shù)如分子標(biāo)記、細(xì)胞和組織培養(yǎng)等操作過程進(jìn)行回顧，重要指出每個(gè)環(huán)節(jié)要用到的必備儀器的作用、性能指標(biāo)、操作注意事項(xiàng)及儀器選購中應(yīng)注意的問題等。二、實(shí)驗(yàn)原理 在pH ，細(xì)菌的線性大分子量染色體DNA變性分開，而共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雖然變性但仍處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)。Xgal（20mg/ml）:20mg Xgal溶于1ml二甲基甲酰胺中，20℃避光保存。溶液III:醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 。2H2O ，加ddH2O至1000ml。加入200ul預(yù)冷的溶液I，重新懸浮細(xì)胞，震蕩混勻（注意：應(yīng)徹底混勻沉淀或碎