【正文】 ，注意不要過干，否則會使以后溶解困難。：向風(fēng)干后的DNA中加入500 ul 1TE，37℃水浴1530分鐘至DNA完全溶解，加5 ul 5 mg/ml Rnase，37℃水浴6小時，然后加入700 181。l苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），上下顛倒離心管約10分鐘，至充分混勻，1000012000 rpm離心5分鐘，吸取上層液至另一離心管中，加入700 181。l氯仿：異戊醇（24：1），顛倒10分鐘（方法同上），10000 –12000 rpm離心5分鐘，吸取上層液至另一離心管中，加入60 181。l 5M NaCl，再加入1 ml冷凍的無水乙醇，輕輕顛倒，然后在20℃冰箱中置30分鐘沉淀DNA，800010000 rpm離心23分鐘，使DNA分散狀緊貼在管壁上，棄酒精，加70%酒精1ml浸泡，2小時后換一次，后浸泡過夜，8000 rpm離心3分鐘后棄酒精，風(fēng)干，加50100 181。l TE充分溶解備用。DNA檢測（1）取DNA原液15 ml，用UV1601型紫外分光光度計測定230 nm、260 nm及280 nm的吸光值。高質(zhì)量的DNA要求：A260/A230； （3）向一定量的DNA中加入限制性內(nèi)切酶EcoR I至45 U/181。g DNA，37℃消化過夜，TBE，%。五、實驗注意事項實驗中的液氮、氯仿、苯酚、EB等都是危險或有毒物質(zhì)，操作時要戴手套，并在專門區(qū)域操作。DAN電泳時只能由負極到正極，電泳時要注意電極是否正確。六、思考題簡述DAN提取的步驟及主要試劑的作用。主要參考文獻華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室柑橘課題組。實驗手冊，2002，武漢（課題組內(nèi)部資料）。實驗四 質(zhì)粒DNA的提取、純化及檢測一、實驗?zāi)康馁|(zhì)粒是攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。質(zhì)粒的分離與提取時最常用、最基本的實驗技術(shù)。質(zhì)粒的提取方法很多，大多包括3個主要步驟：細菌的培養(yǎng)、細菌的收集和裂解、質(zhì)粒DNA的分離和純化。本實驗以堿裂解法為例介紹質(zhì)粒的抽提過程，應(yīng)掌握堿裂解法抽提質(zhì)粒的原理、步驟及各試劑的作用。二、實驗原理 在pH ，細菌的線性大分子量染色體DNA變性分開，而共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雖然變性但仍處于拓撲纏繞狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量RNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。通過離心，可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清液中，然后用酚、氯仿抽提進一步純化質(zhì)粒DNA。三、主要儀器及試材含有質(zhì)粒pUC18載體的大腸桿菌菌液及離心機、移液槍、離心管及質(zhì)粒DNA提取有關(guān)試劑。液氮、及DNA提取有關(guān)試劑。四、實驗方法與步驟（一）試劑配制:LB培養(yǎng)基:NaCl 10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，蛋白胨（Peptone）10g，瓊脂粉15g，加ddH2O至1000ml。分裝至500ml三角瓶（250ml/瓶）。高壓滅菌15min，室溫貯存。Xgal（20mg/ml）:20mg Xgal溶于1ml二甲基甲酰胺中，20℃避光保存。IPTG（200mg/ml）:1g IPTG溶于4ml去離子雙蒸水中，定容至5ml，過濾滅菌后20℃保存。Amp（100mg/ml）:1g Amp溶于4ml去離子滅菌雙蒸水中，定容至5ml，20℃保存。溶液I: 50mM葡萄糖，25mM TrisHCl（pH ），10mM EDTA（pH ）。配制方法：1M TrisHCl（pH ）， EDTA（pH ）10ml，加ddH2O至500ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。溶液II: NaOH，1% SDS。配制方法：2N NaOH 1ml，10% SDS 1ml，加ddH2O至10ml，使用前臨時配制。溶液III:醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 。配制方法：5M KAc300ml，加ddH2O至500ml（視冰醋酸情況，也可按6:3:1配制），貯存于4℃。TE:10mM TrisHCl（pH ），1mM EDTA（pH ）。配制方法：1M TrisHCl（pH ）1ml， EDTA（pH ），加ddH2O至100ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。苯酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）。乙醇（無水乙醇、70%乙醇）。15TBE:Trisbase 54g，EDTANa2H2O ，加ddH2O至1000ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。1溴化乙錠（EB）：10mg/ml1Rnase A（RNA酶A）:不含DNA酶（DNasefree）RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加熱15min，分裝貯存于20℃。16loading buffer（上樣緩沖液）:%溴酚藍，%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。11%瓊脂糖凝膠:稱取1g瓊脂糖與三角燒瓶中，加100ml 1TBE，微波爐加熱至完全熔化，冷卻至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）（注意：EB為強誘變劑，操作時帶手套），輕輕搖勻，緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液1TBE），即可上樣。（二）實驗步驟取含有pUC18質(zhì)粒的大腸桿菌菌液于LB固體培養(yǎng)基上劃線37℃過夜培養(yǎng)。用無菌牙簽或槍頭挑取LB固體培養(yǎng)基上生長的單菌落，接種于20ml含有Amp抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床250r/min過夜培養(yǎng)。12000g離心1min，收集菌體，倒掉菌液；，再次收集菌體，盡量將菌液倒干凈。加入200ul預(yù)冷的溶液I，重新懸浮細胞，震蕩混勻（注意：應(yīng)徹底混勻沉淀或碎塊）。加入400ul新配置的溶液II，輕柔顛倒混勻（不可劇烈震蕩），并將離心管置于冰上23min，使細胞膜裂解（溶液II為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）。加入300ul預(yù)冷的溶液III，溫和顛倒混勻，見白色絮狀沉淀，置于冰上35min，使雜質(zhì)充分沉淀（溶液III為中和液，此時質(zhì)粒DNA復(fù)性，染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性，形成不可溶復(fù)合物，同時K+使SDS蛋白復(fù)合物沉淀）。吸取800ul上清液（注意：不要吸到漂浮的雜質(zhì)）至另一Eppendorf管中，加入2/，混勻，室溫放置5min，4℃離心12000g 15min。倒盡上清，加75%乙醇浸洗沉淀除鹽12次，4℃離心 10000g10min，棄上清，將沉淀在室溫或超凈工作臺上風(fēng)干。將沉淀溶于40ul 滅菌超純水或TE（含RNase A 20ug/ml），37℃水浴30min，以降解RAN，20℃保存?zhèn)溆?。取制備的質(zhì)粒DNA 12ul，加適當loading buffer混勻上樣，1%。五、實驗注意事項實驗中的液氮、氯仿、EB等都是有毒物質(zhì)，操作時應(yīng)注意防護，盡量減少臺面污染。DAN電泳時只能由負極到正極，電泳時要注意電極是否正確。質(zhì)粒電泳檢測一般有三條帶，分別為質(zhì)粒的超螺旋、開環(huán)、線型三種構(gòu)型。六、思考題簡述質(zhì)粒DAN提取的步驟。主要參考文獻華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室柑橘課題組。實驗手冊，2002，武漢（課題組內(nèi)部資料）。實驗五 PCR技術(shù)一、實驗?zāi)康木酆厦告準椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種體外核酸擴增系統(tǒng)，是分子克隆技術(shù)中常用技術(shù)之一。PCR具有反應(yīng)快速、靈敏、操作簡便等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個領(lǐng)域。通過本實驗應(yīng)掌握PCR原理，學(xué)習(xí)PCR操作過程。二、實驗原理PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在環(huán)境下依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)。PCR技術(shù)的特異性取決于引物和模板結(jié)合的特異性。反應(yīng)分為變性、退火、延伸三步，經(jīng)過一定的循環(huán)，介于兩個引物之間的特異DNA片段得到大量擴增。三、主要儀器及試材含有外源cDNA片段的質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)基因蘋果、番茄葉片總DNA；外源基因的特異引物及PCR儀與相關(guān)試劑。四、實驗方法與步驟調(diào)整模板濃度至5ng/ul。按下列體系配制反應(yīng)混合液，混勻，離心5秒（注意加1滴礦物油覆蓋PCR管）。Template DNA2ul（20ng）10buffer MgCl2（25mM） Primer F（10uM） Primer R（10uM） dNTPs（2mM） Taq（5U/ul） Add ddH2O to20ulPCR反應(yīng)循環(huán)條件設(shè)置：95℃3min1cycle 94℃1min55℃1min 72℃90s35cycles 72℃10min1cycle 4℃forever檢測：加2ul溴酚藍，混勻，短暫離心，取15ul反應(yīng)產(chǎn)物點樣電泳在1%瓊脂糖凝膠上點樣電泳；EB染色，紫外觀察。五、實驗注意事項引物設(shè)計應(yīng)具有特異性，依靠引物設(shè)計軟件進行引物設(shè)計；引物分裝成多管，不宜反復(fù)凍融多次；PCR反應(yīng)的各種成分不能遺漏，操作應(yīng)戴手套，冰上操作；根據(jù)引物的Tm值和擴增片段長度以及PCR儀的特性來設(shè)定PCR循環(huán)條件；注意分析電泳檢測PCR產(chǎn)物時出現(xiàn)拖帶或非特異性擴增帶、無DNA帶或DNA帶很弱的可能原因。六、思考題簡述PCR技術(shù)的原理和步驟。主要參考文獻華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室柑橘課題組。實驗手冊，2002，武漢（課題組內(nèi)部資料實驗六 PCR產(chǎn)物的TA克隆一、實驗?zāi)康牟捎猛葱蛄蟹寺√囟ɑ蚧駾NA片段是果樹上常用的分子克隆方法。相對于粘性末端來說，克隆具有平末端的雙鏈PCR產(chǎn)物效率較低。目前，有兩種方法可以采用，一種是在特異引物設(shè)計時引入酶切位點，另一種是TA克隆。通過本實驗應(yīng)掌握PCR產(chǎn)物TA克隆的原理，學(xué)習(xí)PCR產(chǎn)物純化及回收，以及PCR產(chǎn)物與TA克隆載體的連接。二、實驗原理TA克隆是利用耐熱聚合酶，如Taq聚合酶、Tfl、Tth等具有末端轉(zhuǎn)移酶活性，而不具有3’一5’外切酶的校準活性，即在PCR產(chǎn)物的兩個3’末端加上未配對的單一A凸出尾，質(zhì)粒載體提供線性3’末端單一的T凸出尾，使該載體能夠直接與PCR產(chǎn)物高效連接。TA克隆技術(shù)比其它PCR克隆方法有更高的重組效率。三、主要儀器及試材PCR擴增產(chǎn)物、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（Promega公司）、pMD18T載體（TaKaRa公司）以及感受態(tài)大腸桿菌、高速冷凍離心機、移液槍、瓊脂糖凝膠電泳等相關(guān)儀器及試劑。四、實驗方法與步驟PCR擴增片段純化回收將PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，割膠，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒收集PCR擴增產(chǎn)物，具體操作步驟參考試劑盒說明書進行。連接反應(yīng) 反應(yīng)體系組成pMD18T ul PCR fragment ul ddH2O ul Ligation Solution I ul 混合后，置于室溫下放置數(shù)小時或過夜連接。重組子轉(zhuǎn)化（熱激法）1）在含適當濃度的Ampicillin的LB平板上，涂抹4 ul IPTG（200mg/ml）和40 ul xgal（20mg/ml），然后暗置30 min以上；2） ml 離心管； 3）取出感受態(tài)大腸桿菌，冰上放置凍融；4） ml 離心管，加入50 ul感受態(tài)細胞和10 ul連接反應(yīng)液，用移液槍輕輕吸打均勻，在冰上放置30 min；5）熱激：將離心管在42 ℃下水浴90秒鐘。請勿搖動離心管； 6）冰鎮(zhèn)：快速將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴，12分鐘；7）復(fù)蘇：每管加400 ul液體LB培養(yǎng)基，在37 ℃搖床溫和搖動45 min60 min； 8）涂皿：取150 ul均勻涂布于“1）”已制備好的LB平板上；9）培養(yǎng)：在37 ℃下倒置培養(yǎng)1216 h，即可觀察到藍白相間的菌落。白色菌落為含有外源插入片段的轉(zhuǎn)化子，藍色是載體自連的轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子可以在4 ℃下保持1個月；10）單菌落培養(yǎng)：用滅菌的牙簽，挑選白色的單菌落到盛有含50 mg/ml Ampicillin的5 ml液體LB培養(yǎng)基的50 ml離心管中，在37 ℃搖床上培養(yǎng)過夜（1216 h）。質(zhì)粒DNA的分離 參考有關(guān)文獻。檢測采用相同的引物對進行PCR再擴增，或質(zhì)粒上根據(jù)插入片段兩端的酶切位點而進行限制性酶切，通過電泳可以檢測出片段是否克隆成功。五、實驗注意事項連接溫度不宜太高，連接溫度過高（28℃）可使背景增加，使重組克隆菌減少。降低連接溫度可以提高白斑率；熱激過程注意勿搖動離心管。六、思考題簡述PCR產(chǎn)物TA克隆的原理和步驟。主要參考文獻華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室柑橘課題組。實驗手冊，2002，武漢（課題組內(nèi)部資料。