【正文】 降低連接溫度可以提高白斑率；熱激過程注意勿搖動離心管。連接反應 反應體系組成pMD18T ul PCR fragment ul ddH2O ul Ligation Solution I ul 混合后，置于室溫下放置數(shù)小時或過夜連接。實驗手冊，2002，武漢（課題組內部資料實驗六 PCR產物的TA克隆一、實驗目的采用同源序列法克隆特定基因或DNA片段是果樹上常用的分子克隆方法。反應分為變性、退火、延伸三步，經過一定的循環(huán)，介于兩個引物之間的特異DNA片段得到大量擴增。六、思考題簡述質粒DAN提取的步驟。加入300ul預冷的溶液III，溫和顛倒混勻，見白色絮狀沉淀，置于冰上35min，使雜質充分沉淀（溶液III為中和液，此時質粒DNA復性，染色體和蛋白質不可逆變性，形成不可溶復合物，同時K+使SDS蛋白復合物沉淀）。1溴化乙錠（EB）：10mg/ml1Rnase A（RNA酶A）:不含DNA酶（DNasefree）RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加熱15min，分裝貯存于20℃。TE:10mM TrisHCl（pH ），1mM EDTA（pH ）。Amp（100mg/ml）:1g Amp溶于4ml去離子滅菌雙蒸水中，定容至5ml，20℃保存。通過離心，可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質，質粒DNA尚在上清液中，然后用酚、氯仿抽提進一步純化質粒DNA。主要參考文獻華中農業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室柑橘課題組。l 5M NaCl，再加入1 ml冷凍的無水乙醇，輕輕顛倒，然后在20℃冰箱中置30分鐘沉淀DNA，800010000 rpm離心23分鐘，使DNA分散狀緊貼在管壁上，棄酒精，加70%酒精1ml浸泡，2小時后換一次，后浸泡過夜，8000 rpm離心3分鐘后棄酒精，風干，加50100 181。三、主要儀器及試材水浴鍋、離心機、移液槍、研缽、離心管、核酸電泳系統(tǒng)等；新鮮健康植物葉片，液氮、及DNA提取有關試劑。（二）培養(yǎng)基配制母液配好后，按以下體種（或質量）量取，最后用蒸餾水定溶到1L,，用塑料燒杯放入微波爐中充分溶解后分裝滅菌。維生素B的配制（100倍液）：VB組分 VB1(鹽酸硫氨素)VB6(鹽酸吡哆素)VB5(煙酸)改良MT 1g 1g MS 10 mg 50 mg 50 mg 分別稱取順序溶解在溫熱的蒸餾水中，定容到1L。二、實驗原理基于1902年德國科學家哈勃蘭特（Haberlandt）提出植物細胞的全能性理論，即指已分化的細胞仍然具有分化發(fā)育成新個體的潛能。通過現(xiàn)場參觀和老師講解加深同學們對現(xiàn)代分子生物學實驗室的規(guī)劃與布局及常用儀器設備的主要功能的認識，掌握高速冷凍離心機、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)等關鍵儀器的使用方法。？、缺點。，在園藝植物病毒病的防治中常用的策略主要有＿、＿、＿、＿。，新合成鏈的延伸方向是從5’到3’方向。、通過對生物技術的學習，談談生物技術在園藝科學中的應用與展望。：()A：酒精消毒 B：HgCl2消毒 C：NaClO消毒 D：NaCl消毒 most important contribution of Watson and Crick is:()A：蛋白質結構模型 B：RNA結構模型 C：DNA是遺傳物質 D：DNA雙螺旋結構’ATCGTACGGGTT3’，下列虛線部分為500—1000 pb長的DNA區(qū)域，請分析其中能進行2的指數(shù)倍擴增的有：()A: 5’ATCGTACGGGTT— — —3’ B: 5’ — — —ATCGTACGGGTT 3’ C: 5’ ATCGTACGGGTT— — —TACCATGCCCAA 3’ D: 5’ ATCGTACGGGTT— — —TTGGGCATGCAT 3’ ，下列可能是遺傳物質的有：()A：DNA B：RNA C：Protein D：多糖：（）Ａ：原生質體來源 Ｂ：基因型 Ｃ：培養(yǎng)基 Ｄ：滲透壓調節(jié)劑：（）A：cat B:GUS C。、＿、＿等，在導入植物的24~48h內就可以檢測結果，從而可以對轉基因程序的有關因素進行快速評價和優(yōu)化，檢測該基因的方法有＿、＿、＿。，即＿、＿、＿、＿、＿等。，檢測DNA鏈，用是于外源基因整合的鑒定及分析。（RFLP）是用已知的限制性內切酶消化目標RNA，電泳印跡，再用RNA探針雜交并放射自顯影，從而得到與探針同源的RNA序列酶切后在長度上的差異。，基于這一基本的分子生物原理，現(xiàn)在已開發(fā)出許多克隆基因的方法，主要有＿、＿、＿、＿等。，篩選的方法主要有：＿、＿、＿等。，分子量大的片段比分子量小的片段距負極更近。，常用的有藜科、茄科、豆科、十字花科、葫蘆科等植物。六、思考題簡述PCR技術的原理和步驟。二、實驗原理PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在環(huán)境下依賴于DNA聚合酶的酶促反應。取制備的質粒DNA 12ul，加適當loading buffer混勻上樣，1%。用無菌牙簽或槍頭挑取LB固體培養(yǎng)基上生長的單菌落，接種于20ml含有Amp抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床250r/min過夜培養(yǎng)。乙醇（無水乙醇、70%乙醇）。溶液II: NaOH，1% SDS。分裝至500ml三角瓶（250ml/瓶）。質粒的提取方法很多，大多包括3個主要步驟：細菌的培養(yǎng)、細菌的收集和裂解、質粒DNA的分離和純化。通過現(xiàn)場參觀和老師講解加深同學們對現(xiàn)代分子生物學實驗室的規(guī)劃與布局及常用儀器設備的主要功能的認識，掌握高速冷凍離心機、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)等關鍵儀器的使用方法。（3）能源開發(fā)，促進世界經濟的可持續(xù)發(fā)展：隨著世界經濟的發(fā)展，加速了對石油等有限的不可再生礦質能源的消耗，世界各國均面臨著能源枯竭的嚴重問題。四． 綜合題根據(jù)你所學，談談你對轉基因植物的看法。若G+C含量相對偏低，則可以使引物長度稍長，而保證一定的退貨溫度。主要過程：① 稱取植物組織約100200mg，加適量液氮，研磨至組織破碎成粉末狀，迅速轉入2mL離心管。⑥堿性磷酸酶：催化去除DNA、RNA等的5磷酸基團。答：農桿菌介導的植物遺傳轉化是以農桿菌為媒介，將目的基因通過載體上的特定區(qū)域導入細胞，并整合到染色體中。二是實時PCR的縮寫，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。第四，轉入植物的標記基因(特別是抗生素基因),有可能通過某種途徑擴散到其他微生物中并使其產生新的抗藥性，導致超級病原菌的產生。2008年，美國科學家也證實了長時間喂食轉基因玉米，小白鼠的免疫系統(tǒng)會受到損害，該研究成果發(fā)表在同年《農業(yè)與食品化學》雜志上。2004年，瑞士聯(lián)邦技術研究院踢球植物學研究所海爾比克教授發(fā)現(xiàn)，先正達研發(fā)的轉基因Bt176玉米中，用來毒殺歐洲玉米螟的Bt毒素，無法分解，最終毒死了奶牛。例如轉基因大米是通過人為改變大米的基因使其擁有更好的性狀的一種稻子結出來的大米。我們應該對其一分為二地看，既有利也有弊，人們應該客觀地看待其利弊，將其作為一把雙刃劍來使用。人們認為轉基因技術可以在一定程度上通過科學技術手段讓其他生物、植物朝著對人類有利方向發(fā)展的技術。第一篇：植物生物技術我對轉基因技術的認識與體會園藝111班蔡朝途1131100916轉基因技術（Genetically Modified，簡稱GM），是指運用科學手段，將基因片段轉入特定生物中，并最終獲取具有特定遺傳性狀個體的技術。特別是遺傳學創(chuàng)立后近百年的轉基因育種則是采用人工雜交的方法，進行優(yōu)良基因的重組和外源基因的導入而實現(xiàn)遺傳基因的改良。凡事都有兩面性，對于轉基因技術我們不能全部的否定也不能全部的肯定。它可能是更具有抗?jié)场⒖购?、抗蟲害、增加了大米里的蛋白質含量。2005年5月22日，英國《獨立報》又披露了知名生物技術公司“孟山都”的一份報告，以轉基因食品喂養(yǎng)的老鼠出現(xiàn)器官變異和血液成份改變的現(xiàn)象。2009年12月，法國科學家發(fā)表了新的研究結果并證實，孟山都公司出產的轉基因玉米對大鼠的肝臟和腎臟具有毒性，這些副作用是性別依賴的、也時常是劑量依賴的；其他副作用也見于大鼠的心臟、腎上腺、脾和造血系統(tǒng)?？傊?，轉基因技術的發(fā)展是不可逆轉的。3．Northern blot：是一種通過檢測RNA的表達水平來檢測基因表達的方法，通過Northern blot可以檢測到細胞在生長發(fā)育特定階段或者脅迫或病理環(huán)境下特定基因表達情況。主要過程為：①分離目的基因片段；②將目的片段鏈接到克隆載體上，形成重組DNA分子；③將重組DNA分子轉移到適當?shù)氖荏w細胞進行增殖；④從細胞中篩選重組子；⑤提取已經擴增的基因，進一步分析研究；⑥將目的基因克隆到表達載體，一般采用雙元載體；⑦利用表達載體轉化農桿菌；⑧利用農桿菌轉化植株，常用的方法有原生質體法、真空滲入法和蘸花法3種。⑦依賴DNA的RNA聚合酶：識別特異性啟動子，RNA轉錄。② 在離心管中加入1mL 65℃CTAB提取液(100mmol/L的TrisHCl，20mmol/L的EDTA，4%的β巰基乙醇)，放至65℃水浴30min，其間輕搖3次以混勻反應液。④G+C含量：有效引物中的G+C含量一般為40%60%。答：自1983年美國在世界上首次獲得轉基因煙草以來，植物轉基因技術得到了迅速發(fā)展，在世界范圍內得到了廣泛的應用。（4）減少環(huán)境污染，保護人類賴以生存的自然環(huán)境：轉基因技術可以生產許多抗性強、適應性廣的植物，最大限度地利用土地資源，增加全球植被的覆蓋率，減少水土流失和土地沙漠化，減少因CO2增加引起的溫室效應。二、實驗場所選擇及實驗內容園藝學院植物分子生物技術實驗室與開展現(xiàn)代生物技術研究直接相關的實驗室分工與布局和主要相關儀器：如與組織培養(yǎng)有關的超凈工作臺、高壓滅菌鍋、接種至、培養(yǎng)室等；與分子生物學有關的高速冷凍離心機、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)等。本實驗以堿裂解法為例介紹質粒的抽提過程，應掌握堿裂解法抽提質粒的原理、步驟及各試劑的作用。高壓滅菌15min，室溫貯存。配制方法：2N NaOH 1ml，10% SDS 1ml，加ddH2O至10ml，使用前臨時配制。15TBE:Trisbase 54g，EDTANa，12000g離心1min，收集菌體，倒掉菌液；，再次收集菌體，盡量將菌液倒干凈。五、實驗注意事項實驗中的液氮、氯仿、EB等都是有毒物質，操作時應注意防護，盡量減少臺面污染。PCR技術的特異性取決于引物和模板結合的特異性。第四篇：園藝植物生物技術 試卷（模版）一、將下面詞組相對應的中文譯成拉丁文或拉丁文譯成中文。，而花粉培養(yǎng)則屬于器官培養(yǎng)的范疇。、＿、＿等四種。？。，大多數(shù)與細胞培養(yǎng)相似。；組織培養(yǎng)中外植體再生的兩種主要途徑是_______和_______。Ant D:GFP：（）A：免疫注射 B：細胞融合 C：篩選 D：克隆化：（）Ａ：準備室 Ｂ：制備室 Ｃ：無菌操作室 Ｄ：培養(yǎng)室:()A：有性雜交 B：體細胞雜交 C：組織培養(yǎng) D：基因克隆：（）Ａ：種質資源保存 Ｂ：原生質體融合 Ｃ：篩選突變體 Ｄ：遺傳轉化：（）A：對稱融合 B：非對稱融合 C：配子—體細胞融合 D：：（）A：兩側的引物 B：DNA模板 C：TaqDNA聚合酶 D：Mg+ :（）A：血清學檢測 B：PCR檢測 C：同工酶檢測 D：指示植物鑒定：（）A：黃龍病 B：裂皮病 C：線蟲病 D：速衰病’ATCG TACG GGTT3’，則能與其互補配對的另一條鏈可能是：（）A：5’ATCG TACG GGTT3’ B：5’AACC CGTA CGAT3’ C：3’TAGC ATGC CCAA5’ D：3’UAGC AUGC CCAA5’：（）A：ELISA B：Southern雜交 C：Western雜交 D：Northern雜交：（）A：農桿菌介導轉化 B：基因槍法 C：PEG轉化法 D：電泳法，主要表現(xiàn)在：（）Ａ：搶救發(fā)育不良或早期退化胚 Ｂ：克服遠緣雜交不親和 Ｃ：用于柑橘合子胚搶救 Ｄ：三倍體育種：（）A：脫毒與快速繁殖 B：花藥培養(yǎng)以及小孢子培養(yǎng) C：胚搶救技術 C：細胞融合技術：（）Ａ：植物的類型 Ｂ：基因型 Ｃ：外植體類型 Ｄ：生理狀態(tài)五、簡答題：將下列各題的答案填在下面的方框內。、如果現(xiàn)已證明園藝植物的某一重要農藝性狀是單基因控制的質量性狀，且發(fā)現(xiàn)了一個與控制該性狀的基因緊密連鎖的分子標記。，往往不能進行高壓滅菌，通常采用過濾滅菌，即先將除去了這些不耐熱物質的培養(yǎng)基的其他成份經高壓滅菌后放