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【正文】 二、免疫標記技術(shù)用的抗體類試劑 ? 免疫酶抗體診斷試劑 ? 免疫酶技術(shù)是用酶標記抗體來檢測抗原的方法，本法分為免疫酶染色（組化法）和酶免疫測定（ EIA） 兩種類型。建庫的外源基因來自人外周血、骨髓或脾臟的淋巴細胞提取的 mRNA反轉(zhuǎn)錄形成的 cDNA擴增，使用的通用引物采自多個人體，具有人的種屬普遍性。 五、抗體融合蛋白 ? 構(gòu)建抗體融合蛋白的原則是：將第一個蛋白的終止密碼子刪除，再接上帶有終止密碼子的第二個蛋白基因，即可實現(xiàn)兩個基因共表達。 ? 化學(xué)交聯(lián)法 ? 生物學(xué)方法（雜種 雜交瘤）雜交瘤細胞與脾細胞融合得到可分泌兩種親代抗體和雜種抗體的 雜種 雜交瘤細胞?，F(xiàn)在研制的小分子抗體有以下幾種類型： ? （ 1） Fab抗體，由完整的輕鏈和重鏈（ VH和 CH1） 所組成。 二、改形抗體 ? Ig分子中參與構(gòu)成抗原結(jié)合部位的區(qū)域是 H和 L鏈 V區(qū)中的互補性決定區(qū)（ CDR區(qū)），而不是整個可變區(qū)。 IgG與蛋白 A的結(jié)合與 pH有密切關(guān)系，鼠源性單克隆抗體在 ， IgG2b、 IgG3幾乎全部結(jié)合于蛋白 A柱上， IgG1稍差，用 緩沖液可洗脫 IgG2b， IgG3， IgG2a， 脫下 IgG1。常用 Sephadex G200作分離介質(zhì)，可收集到三個峰，最高峰為 IgM， 另兩個峰為 IgG， 抗體回收率達50%~80%，能去除污染的微量雜蛋白，抗體純度可達95%以上。 ? 利用懸浮培養(yǎng)方式可增加細胞生長空間，雜交瘤細胞生長旺盛，單克隆抗體產(chǎn)量得到提高。另外根據(jù)需要不同，還應(yīng)對單克隆抗體的特異性、純度和識別抗原的相對分子量等進行測定。 三、篩選陽性克隆與克隆化 ? （ 2）克隆化 —— 有限稀釋法和軟瓊脂法 ? 軟瓊脂法是在培養(yǎng)液中加入 %左右的瓊脂糖凝膠，細胞分裂后形成小球樣團塊，由于培養(yǎng)基是半固體狀態(tài)，可用毛細吸管將小球吸出，團塊打碎后，移入 96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。一般來說，免疫酶技術(shù)和放射免疫技術(shù)均適用于可溶性抗原及顆粒性抗原的抗體檢測。在融合后 7天內(nèi)用 HAT培養(yǎng)液，殺死瘤 瘤融合細胞后，第 7~14天改用 HT培養(yǎng)液，14天以后用普通的 RPMI1640 完全培養(yǎng)液（配方書中表 43），從融合后 8~9天就可對所有克隆生長孔的培養(yǎng)上清進行抗體檢測，篩選出產(chǎn)生抗體的陽性克隆。但相對分子量400~6000，濃度在 10%~50%范圍之間的 PEG都能使細胞融合。其基本方法是用 4~8周齡 BALB/c小鼠的脾臟制成單個細胞懸液，再加入適當抗原使其濃度達 ~5 ?g/ml， 在 5%CO37℃ 下培養(yǎng) 4~5天，再分離脾臟細胞，進行細胞融合。不同品系的小鼠與大鼠在對某類抗原的免疫應(yīng)答上是不同的。 單克隆抗體和 多克隆抗體的制備 抗原 脾 B淋巴細胞 融合 融合 淋巴細胞 骨髓瘤細胞 克隆 1 克隆 2 克隆 3 克隆 4 第二節(jié) 單克隆抗體 ? 一、抗原與動物免疫 ? 二、細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng) ? 三、篩選陽性克隆與克隆化 ? 四、雜交瘤細胞與抗體性狀的鑒定 ? 五、單克隆抗體的大量制備 ? 六、單克隆抗體的純化 一、抗原與動物免疫 ? （ 1）制備用于動物免疫的適當抗原。但是要解決以下兩個問題 ：（ 1）鼠源性單克隆抗體的免疫原性；（ 2）完整的抗體分子分子量過大，難以穿透實體腫瘤組織，達不到有效的治療濃度。 ? 1937年： Tiselius等人用電泳法將血清蛋白分為白蛋白、甲種（ ?）球蛋白、乙種（ ? ）球蛋白和丙種（ ? ）球蛋白，并證明抗體活性主要存在于丙種球蛋白組分。 單克隆抗體的應(yīng)用 ? 用于疾病的診斷和治療：如利用單克隆抗體檢測與某些疾病相關(guān)的抗原，輔助臨床診斷，或用放射性核素標記 單克隆抗體進行腫瘤顯像，進行免疫鑒定。由于這種抗體是針對一個抗原決定簇的抗體，又是單一的 B淋巴細胞克隆產(chǎn)生的，因此稱為單克隆抗體。 一、抗原與動物免疫 ? （ 2）穩(wěn)定的雜交瘤的獲得 ? 因免疫動物品系和骨髓瘤細胞在種系發(fā)生上距離越遠，產(chǎn)生的雜交瘤越不穩(wěn)定，故一般采用與骨髓瘤供體同一品系的動物進行免疫。有人認為在常規(guī)免疫的基礎(chǔ)上用脾內(nèi)免疫法做追加免疫較佳。 二、細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng) ? （ 3）誘導(dǎo)劑 PEG的影響： PEG分子量以及濃度越大，促融率越高。脾 脾融合細胞和瘤細胞在這樣的條件下，幾天內(nèi)亦迅速死亡。 三、篩選陽性克隆與克隆化 ? （ 1）篩選陽性克?。? ? 因為產(chǎn)生特定抗原的抗體產(chǎn)生細胞只占所有脾細胞的5%左右，所以要進行每孔培養(yǎng)上清的抗體活性的篩選工作，以選擇出陽性克隆，然后進行克隆化培養(yǎng)。 ? 有限稀釋法是把雜交瘤細胞懸液稀釋后，加入到 96
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