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植物生物技術(shù)講稿-wenkub.com

2024-10-30 17:47 本頁面
   

【正文】 1. 收集 :原生質(zhì)體混合液用濾網(wǎng) (40100181。一般常用溫度是 23320C。 5. 培養(yǎng)條件 :最主要的是酶處理時的溫度和 pH。 3. 滲透壓: 原生質(zhì)體操作需要在一定滲透壓存在下進(jìn)行,常用的配制分離 52 原生質(zhì)體酶液的溶液以及洗滌原生質(zhì)體的溶液為 CPW 液, CPW 鹽成分為: KH2PO4 KNO3 KI pH 根據(jù)滲透劑的濃度和成分可分 為以下幾種培養(yǎng)基 : CPW13M: CPW 鹽 +13%甘露醇 (mannitol) CPW9M: CPW 鹽 +9%甘露醇 CPW21S: CPW 鹽 +21%sucrose CPW0M: CPW 鹽溶液。 常用的酶制劑及其生產(chǎn)廠家有: 纖維素酶有 Cellulase Onozuka R10 ( Kinki Yakult Manuf. Co. Ltd., Nishinomiya, 日本), Cellulase Onozuka RS ( Kinki Yakult Manuf. Co. Ltd., Nishinomiya, 日本), Cellulase ( Sigma), Driselase ( Kyowa Hakko Kogyo Co. ,日本)。 選用懸浮細(xì)胞作材料時,需每隔 35 天繼代一次,培養(yǎng)一段時間使細(xì)胞 51 處于旺盛生長狀態(tài)。用 于原生質(zhì)體分離的植物外植體有葉片、葉柄、莖尖、根、子葉、莖段、胚、愈傷組織、懸浮培養(yǎng)物( Suspension cultures)、原球莖、花瓣和葉表皮等。 (二)影響原生質(zhì)體分離的因素(酶法) 從理論上講,只要用適當(dāng)?shù)拿柑幚?,就能從任何活組織中分離得到原生質(zhì)體。原生質(zhì)體可以用于下面幾種研究。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)利用小孢子培養(yǎng)與常規(guī)育種相結(jié)合,培育出 ―華雙 3 號 ‖雙低油菜品種,累計推廣面積達(dá)3000 萬畝。 七、單倍體誘導(dǎo)中存在的問題 對于多數(shù)植物來講,能形成有活力的胚的花藥百分率很低,除此之外,還有很多問題存在: ? 通?;ㄋ幓蚧ǚ垭x體培養(yǎng)時沒有生長和發(fā)育的現(xiàn)象,或剛開始生長便導(dǎo)致胚敗育 ? 在產(chǎn)生單倍體的同時也產(chǎn)生二倍體和四倍體 ? 培養(yǎng)時我們需要小孢子分裂,而二倍體組織不分裂,但這種情況往往難以辦到 ? 白化苗難以避免,尤其是禾本科作物 ? 在混倍性的材料中很難分離出單倍體出來 ,因為單倍體細(xì)胞的生長很易被更強(qiáng)生長力的多倍體細(xì)胞掩蓋掉 ? 單倍體加倍并不總是能產(chǎn)生純倍體,純倍體的雙單倍體有時表現(xiàn)出后代分離 八、單倍體細(xì)胞培養(yǎng)與植物育種 我國花培育種技術(shù)走在世界前列,育成各種農(nóng)作物新品種幾十個,有的已推廣很大面積,在生產(chǎn)上發(fā)揮著重要作用。 分離花粉的方法 3. 花粉 /小孢子培養(yǎng)方法 ? 液體淺層培養(yǎng) ? 平板培養(yǎng)法 ? 看護(hù)培養(yǎng)法 ? 微室懸滴培養(yǎng)法 ? 條件培養(yǎng)法 六、禾本科植物花藥培養(yǎng)中的白化苗現(xiàn)象 禾谷類植物花粉單倍體生產(chǎn)中存在的一個嚴(yán)重問題是出現(xiàn)大量白化苗。 秋水仙素處理也可通過羊毛脂進(jìn)行,即把含有秋水仙素的羊毛脂涂于上部葉片的腋芽上,然后將主莖的頂芽去掉,以刺激側(cè)芽長成二倍體的可育枝條。 單倍體植株的加倍處理 45 單倍體植株通常情況下表現(xiàn)為植株矮小,生長瘦弱,由于染色體在減數(shù)分裂時不能正常配對,所以表現(xiàn)為高度不育。二周后,這類花粉粒進(jìn)行細(xì)胞分裂,成為二細(xì)胞的 ―原胚 ‖,并繼續(xù)分裂形成多細(xì)胞的球形胚。有些作物的花藥對培養(yǎng)基的 pH 值有一定要求。因此,在進(jìn)行花藥培養(yǎng)時,進(jìn)行細(xì)致的激素方面的實(shí)驗是必要的。用EMS、酒精、射線、降低氣壓、高低滲處理進(jìn)行預(yù)處理的也有報道。這種現(xiàn)象即花粉的二型性。在煙草中,處于第一次有絲分裂期的花粉效果最好,而在禾本科和蕓苔屬中,單核早期最好。蕓苔屬的一些種(油菜),高光強(qiáng)和一定的溫度變化較有利,對于甘藍(lán)型冬油菜來講,植株在 150C 下生長比 200C 下好。起源于同源或異源多倍體的多倍單倍體減數(shù)分裂時染色體的行為大不相同,如 AAAA 的單倍體為 AA,而 AABB 的單倍體為 AB,前者具有正常的染色體減數(shù)分裂行為,后者類似于一倍單倍體。在 Capiscum 中,雙生苗的頻率受母本基因型控制。 花粉用射線照 射后失去了受精能力,然后與母株授粉,卵細(xì)胞在花粉的刺激作用下進(jìn)行孤雌發(fā)育,從而產(chǎn)生單倍體。遠(yuǎn)緣雜交中,異種植物雖然不能與母本授粉、受精,由于遠(yuǎn)緣花粉的誘導(dǎo)作用,卵細(xì)胞在沒有受精的情況下受刺激而發(fā)育成胚。 單倍體是指具有配子染色體數(shù)的個體或組織,即體細(xì)胞染色體數(shù)為 n。要求講課的學(xué)生準(zhǔn)備多媒體,并查閱相關(guān)資料,圖文并茂。細(xì)胞分裂素在胚誘導(dǎo)中不具關(guān)鍵作用。 5. 內(nèi)源激素水平的變化 培養(yǎng)細(xì)胞的內(nèi)源激素水平對胚狀體發(fā)生可能有更直接的影響。一般以幼嫰組織作外植體較易誘導(dǎo)胚狀體。 2. 含氮化合物 ? NH4+與 NO3+的作用不同 ? NH4+/NO3+的比例 ? 氨基酸、酰胺 等有機(jī)氮 3. 其它外部因素 六、影響胚狀體發(fā)生和發(fā)育的內(nèi)部因素 培養(yǎng)個體的遺傳基礎(chǔ)決定了離體培養(yǎng)的反應(yīng)能力。后來的研究發(fā)現(xiàn),絕大多數(shù)植物均屬于這一模式,但不同的植物在含生長素時胚狀體發(fā)育時期不一樣,有的只能產(chǎn)生胚性愈傷,有的可達(dá)圓球胚,有的可達(dá)魚雷胚,個別植物可發(fā)育到成熟胚,但是這些不同發(fā)育程度的胚狀體都必須在轉(zhuǎn)移到無生長素或生長素含量很低的培養(yǎng)基上以后才能繼續(xù)發(fā)育和成株 (2) 細(xì)胞分裂素類物質(zhì) 細(xì)胞分裂素不僅沒有誘導(dǎo)的作用 (單獨(dú)使用不能誘導(dǎo)愈傷 ),而且對已完成誘導(dǎo)的愈傷組織中胚狀體的發(fā)生還有抑制作用。 胚狀體可按其來源分為兩大類:一類是由普通植物體(孢子體)的各種器官等雙倍體的體細(xì)胞產(chǎn)生的胚狀體,也稱之為體細(xì)胞胚;另一類是由小孢子或其分裂產(chǎn)物等單倍體細(xì)胞產(chǎn)生的胚狀體,通常稱 為花粉胚,可發(fā)育成單倍體植株。 ? 是研究胚發(fā)育的良好材料體系。 ? 速度快。 胚狀體發(fā)生在高等植物中是一個普遍現(xiàn)象,既包括雙子葉植物,也包括單子葉植物;既包括許多草本植物,也包括許多木本植物。光質(zhì)對于某些植物可能也很重要。生長素與根形成有關(guān),同時對于愈傷組織的保持也是必須的。 ⑷先根后芽:有些植物外植體脫分化后在愈傷組織上先分化出根,而后在靠近愈傷組織的根部上再分化出芽,有的將根切下放入分化培養(yǎng)基,再于根上分化出芽器官,甚至在根端也能分化出 芽。 ⑵雙極分化:愈傷組織中隨著細(xì)胞分裂出現(xiàn)兩個或兩個以上分生中心,其中有的分化芽,有的分化根,根芽之間并無輸導(dǎo)等組織溝通,在培 養(yǎng)瓶內(nèi)靠愈傷組織提供養(yǎng)料,這種以愈傷組織隔離著的芽和根的苗,常常不能移栽成活。體細(xì)胞胚是一個二極結(jié)構(gòu),不物理地附著于原組織,每一個體細(xì)胞胚稱為胚狀體,它可以同合子胚一樣發(fā)育成植株。 三、懸浮培養(yǎng)物的繼代和生長情況檢測 比固體培養(yǎng)繼代時間短得多,一般每周或每兩周繼代一次。接種時必須有足夠多的細(xì)胞塊,以保證有較合適的細(xì)胞密度。繼代時一般情況下不需改變原培養(yǎng)基的成分,但很多物種需要將生長素降低些,尤其是使用 2, 4D 時。 二、愈傷組織的繼代培養(yǎng) 愈傷組織培養(yǎng)一段時間后必須轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上以保持培養(yǎng)物的繼續(xù)正常生長,更換一次培養(yǎng)基稱一代繼代培 養(yǎng) (subculture) 。這時組織細(xì)胞代謝十分活躍,發(fā)生了一系列生理生化及形態(tài)的變化。 外植體已分化的活細(xì)胞在外源激素的作用下,通過脫分化起動而進(jìn)入分裂狀態(tài),并開始形成愈傷組織。 3. 愈傷組織誘導(dǎo) 愈傷組織的誘導(dǎo)采用的培養(yǎng)基的基本成分相似,但對于不同植物,同一植物不同物種都要對培養(yǎng)成分作相應(yīng)改動,尤其是激 素的成分和濃度是極為重要的因素。 2. 外植體材料的準(zhǔn)備與消毒 外植體的消毒一般采用次氯酸鈉 (市面上售的一般為 1014%有效氯 ),使用時按 1:10稀釋 ,消毒時間以材料定 ,消毒后無菌水沖洗 45次 。 第一節(jié) 愈傷組織的誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng) 一、愈傷組織的誘導(dǎo)與培養(yǎng) 1. 外植體的選擇 選擇外植體要綜合考慮以下幾個因素 : ①大小要適宜 ,不宜太小。體細(xì)胞再生植株技術(shù)的理論與應(yīng)用價值。 ? 三倍體在植物產(chǎn)量與品種改良中具有十分重要的意義。 ? 研究棉花的纖維發(fā)育 二、培養(yǎng)方法 取回花蕾 , 去除苞葉、萼片,將子房消毒,無菌狀態(tài)下取出胚珠,接種于培養(yǎng)基中。Maheshwari 將授粉 5 天的罌粟( Papaver somnierum)胚珠進(jìn)行離體培養(yǎng),得到種子。起源于低緯度地區(qū)的喜溫植物要求較高的溫度,而起源于高緯度地區(qū)的耐低溫植物所需的溫度相對較低。 培養(yǎng)基 成熟胚培養(yǎng)只要求含有無機(jī)營養(yǎng)元素、幾種維生素和少量激素的基本培養(yǎng)。通過幼胚培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織, 經(jīng)植株再生同樣可得到遠(yuǎn)緣雜種。 21 離體胚培養(yǎng)時,胚的發(fā)育有以下幾種可能性途徑:( 1)胚胎發(fā)育途徑:幼胚經(jīng)過心形期,再發(fā)育到魚雷形期,進(jìn)而進(jìn)入子葉期,最后萌發(fā)成苗。這些果實(shí)被稱做 ―Makapuno‖。 蘭花、天麻的種子成熟時,胚只有 6~7 個細(xì)胞,多數(shù)胚不能成活。例如薔薇屬植物的栽培品種常需 1 年才能開花。 蘋果屬的一 些品種,種子播種后在土壤中需幾個月才能萌發(fā),離體培養(yǎng)的胚卻能在 48h 萌發(fā), 4 周內(nèi)形成移植幼苗, 5 個月的幼苗長達(dá)1 m 高。 ,提早結(jié)實(shí) 植物休眠從幾天到幾年不等。在很多種間和屬間雜交中,受精作用能正常完成,胚也能進(jìn)行早期的發(fā)育,但由于胚乳發(fā)育不良,雜種胚最終將會夭折,因而不能形成有發(fā)芽能力的種子。 思考題: 1. 掌握本章講述的概念和名詞,要求理解并記憶 2. 如何理解植物細(xì)胞的全能性? 3. 滅菌的方法包括哪兩類,每類包括寫什么方法,基本原理是什么? 4. 哪些物質(zhì)不能該溫高壓滅菌? 5. 常用的培養(yǎng)基有哪幾種,每種培養(yǎng)基的特點(diǎn)? 6. 培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分分為哪幾大 類?大量元素和微量元素是如何劃分的,其中大量元素包括哪集中? 各種激素的溶解方法? 7. 為什么要配制培養(yǎng)基的母液?配制母液時應(yīng)注意那些事項?為什么鐵鹽使用螯合鐵? 8. 為了保證消毒徹底,從自然條件下取外植體時應(yīng)注意什么問題? 18 第二章 胚胎培養(yǎng) 學(xué)時分配: 2 學(xué)時 教學(xué)目的: 要求掌握胚培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)和胚乳培養(yǎng)的意義,尤其是在育種工作中的實(shí)用價值。 三、無菌培養(yǎng) 材料接種后應(yīng)移入培養(yǎng)室培養(yǎng),一般培養(yǎng)室要求非常衛(wèi)生、恒溫,有理想的光照控溫系統(tǒng),一般材料要求 250C 左右,晚上一般不應(yīng)低于 200C。燒灼過的器械要冷卻后才能使用工作臺面上的用品要放置有序、布局合理。 二、無菌操作 開始操作前要用 70%酒精消毒手和前臂 。 – 封口 – 滅菌 – 對于不能用高壓滅菌的藥品來講,經(jīng)過濾滅菌后的藥液等到高壓滅菌的培養(yǎng)基冷卻到大約 60℃時,在超凈工作臺加入到培養(yǎng)基中,搖勻。 – 加蒸餾水直至培養(yǎng)基的最終容積。 E)激素 每種激素必須單獨(dú)配成母液,其濃度為 , 或 , 多數(shù)激素難溶于水,配法如下: IAA、 IBA、 GA3 先溶于少量酒精,再加水定溶至一定刻度 NAA 可溶于熱水或少量酒精中,再加 水定溶至一定刻度 2, 4D 不溶于水,可用 1 mol 的 NaOH 溶解后再定溶 KT 和 BA 先溶于少量 1 mol HCl 中,再加水定溶 14 玉米素先溶于少量 95%酒精中,再加水定溶。一般采用螯合鐵,即硫酸亞鐵與 EDTA 鈉鹽的混合物。 減少極微量藥品在每次稱量時造成的誤差 ,一般需準(zhǔn)備四種母液 : 13 A) 大量元素母液 : 可配成 10 倍母液 ,用時每 配 1000ml 培養(yǎng)基取 100ml 母液。 二、培養(yǎng)基的種類和特點(diǎn) 目前發(fā)展出的培養(yǎng)基有幾十種,但常用的有 MS、 B white、 N KM8P、SH 等。 細(xì)胞分裂素: 細(xì)胞分裂素影響植物細(xì)胞分裂、頂端優(yōu)勢的變化和莖的分化 12 等。在植物組織培養(yǎng)中常用的生長素有: IAA(吲哚乙酸)、 IBA(吲哚丁酸)、 NAA(萘乙酸)、 NOA(萘氧乙酸)、 P—CPA(對氯苯氧乙酸)、2, 4D(二氯苯氧乙酸)和 2, 4, 5T(三氯苯氧乙酸)。碳源除了作為植物生長發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)以外,另一重要的功能是調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的滲透壓 。其中硫胺素(維生素 B1)一般認(rèn)為是一種必需的成分。后 6種元素需要的數(shù)量較小,因此稱為微量元素或次要元素。 一、培養(yǎng)基的成分 培養(yǎng)基中包括植物生長必需的 15 種營養(yǎng)元素和某些生理活性物質(zhì),可概括為三大類: ( 1)無機(jī)營養(yǎng)物 無
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