【文章內(nèi)容簡介】 在光能抑制未成熟胚的早熟萌發(fā)。 22 第二節(jié) 胚珠培養(yǎng) 一、胚珠培養(yǎng)的用途 ? 成熟胚很小時，胚培養(yǎng)難以成功，采用胚珠培養(yǎng)較易成功 。Maheshwari 將授粉 5 天的罌粟（ Papaver somnierum）胚珠進(jìn)行離體培養(yǎng)，得到種子。罌粟授粉 5 天的胚珠僅為合子胚或只有 2 個細(xì)胞的原胚 。 ? 對未 受精的胚珠進(jìn)行培養(yǎng)可誘發(fā)大孢子發(fā)育成單倍體植物 。 ? 在棉花種間雜交中，通過胚珠培養(yǎng)可以防止由于棉鈴脫落 喪失雜種胚。 ? 研究棉花的纖維發(fā)育 二、培養(yǎng)方法 取回花蕾 , 去除苞葉、萼片，將子房消毒，無菌狀態(tài)下取出胚珠，接種于培養(yǎng)基中。 三、影響胚珠培養(yǎng)成功的因素 培養(yǎng)基的基本組成 （ 1）培養(yǎng)條件 激素 有機(jī)成分 （ 2）胚的發(fā)育時期 （ 3）胎座和子房 23 第三節(jié) 胚乳培養(yǎng) 一、胚乳培養(yǎng)的意義 ? 自然條件下，胚乳細(xì)胞以淀粉、蛋白質(zhì)和脂類的形式貯存著大量的營養(yǎng)物質(zhì)，以供胚胎發(fā)育和種子萌發(fā)之需。因此，胚乳是研究這些天然產(chǎn)物代謝過程的一個理想系統(tǒng)。 ? 胚乳培養(yǎng)作為通過三倍體而獲得產(chǎn)生無籽果實(shí)植株的一種手段，倍受國內(nèi)外果樹育種家重視。 ? 三倍體在植物產(chǎn)量與品種改良中具有十分重要的意義。有些具有重要經(jīng)濟(jì)價值的植物，蘋果、香蕉，桑樹、甜菜、茶和西瓜等其三倍體已在生產(chǎn)中得到了利用，并顯示出較好的經(jīng)濟(jì)效益 ? 三倍體植株加倍可產(chǎn)生同源六倍體。同源六倍體在植 物育種上具有重要的價值。 二、影響胚乳培養(yǎng)的因素 1. 胚乳發(fā)育時期 思考題： 1． 進(jìn)行胚培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)各有什么意義或用途？ 24 2． 胚在離體培養(yǎng)條件有有幾種發(fā)育途徑？ 第三章 愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代和培養(yǎng) 教學(xué)時數(shù)： 5 學(xué)時 教學(xué)目的： 要求掌握愈傷組織誘導(dǎo)、繼代、培養(yǎng)與分化的基本術(shù)語和概念；掌握器官發(fā)生與體細(xì)胞胚胎發(fā)生的區(qū)別與聯(lián)系；掌握促進(jìn)細(xì)胞分化的方法手段。體細(xì)胞再生植株技術(shù)的理論與應(yīng)用價值。 植物細(xì)胞全能性 (totipotency)： 植物體細(xì)胞或性細(xì)胞，在人為控制的培養(yǎng)條件下都具有再生成新個體的潛能，因而在適宜的條件下可以被誘導(dǎo)生長分化形成完整植株。 脫分化 （ dedifferentiation）： 使已分化的體細(xì)胞回復(fù)到未分化的原始狀態(tài)并具有細(xì)胞全能性表達(dá)潛力的過程 。 再分化 （ redifferentiation）： 處于脫分化狀態(tài)的愈傷組織再度分化成類型的細(xì)胞、組織、器官，甚至最終再生成完整的植株過程。 第一節(jié) 愈傷組織的誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng) 一、愈傷組織的誘導(dǎo)與培養(yǎng) 1. 外植體的選擇 選擇外植體要綜合考慮以下幾個因素 : ①大小要適宜 ,不宜太小。外植體的組織塊要達(dá)到 2 萬個細(xì)胞（ 510mg）以上才容易成活；②同一植物不同部位的外植體，其細(xì)胞的分化能力、分化條件及分化類型有相當(dāng)大的差 25 別；③植物胚與幼齡組織器官比老化組織、器官更容易去分化，產(chǎn)生大量的愈傷組織；④不同物種相同部位的外植體其分化能力可能大不一樣?？傊?，外植體的選擇一般以幼嫩的組織或器官為宜。用于培養(yǎng)的外植體包括根、莖、葉、果實(shí)、子房、花粉、花瓣等各種器官或組織。 2. 外植體材料的準(zhǔn)備與消毒 外植體的消毒一般采用次氯酸鈉 (市面上售的一般為 1014%有效氯 ),使用時按 1:10稀釋 ,消毒時間以材料定 ,消毒后無菌水沖洗 45次 。 或用 %升汞消毒。 如果沒有特殊的條件要求，在無菌條件下發(fā)芽種子能產(chǎn)生無菌的根、莖、葉 (無菌苗 )，較適于誘導(dǎo)愈傷組織。種子是誘導(dǎo)愈傷組織的很好的起始材料，因?yàn)椋孩倏蓪⒄７N子放在加有生長物質(zhì)的培養(yǎng)基上使其直接產(chǎn)生愈傷組織；②在無激素的培養(yǎng)基上發(fā)芽，可產(chǎn)生無菌的根、莖、葉用作外植體；③可直接從種子上剪下根原基及芽尖用作外植體。 3. 愈傷組織誘導(dǎo) 愈傷組織的誘導(dǎo)采用的培養(yǎng)基的基本成分相似，但對于不同植物，同一植物不同物種都要對培養(yǎng)成分作相應(yīng)改動，尤其是激 素的成分和濃度是極為重要的因素。生長調(diào)節(jié)物質(zhì)之中，特別是生長素，對于細(xì)胞分裂的誘導(dǎo)以及在其后的生長和增殖，都是必要的物質(zhì)。細(xì)胞分裂素未必是必需的物質(zhì)，然而，常常因不同的供試材料而異。 從單個細(xì)胞或外植體上脫分化形成典型的愈傷組織，大致經(jīng)歷三個時期：起動期、分裂期和形成期 : 26 起動期，又稱為誘導(dǎo)期 ,是愈傷組織形成的起點(diǎn)。 外植體已分化的活細(xì)胞在外源激素的作用下，通過脫分化起動而進(jìn)入分裂狀態(tài)，并開始形成愈傷組織。這時在外觀上雖然未見明顯變化，但實(shí)際上細(xì)胞內(nèi)一些大分子代謝動態(tài)已發(fā)生明顯的改變，細(xì)胞正積極為下一步 分裂進(jìn)行準(zhǔn)備。 分裂期 。 外植體切口邊緣開始膨大，外層細(xì)胞通過一分為二的方式進(jìn)行分裂，從而形成一團(tuán)具有分生組織狀態(tài)細(xì)胞的過程。這時組織細(xì)胞代謝十分活躍，發(fā)生了一系列生理生化及形態(tài)的變化。 形成期 。 是指外植體的細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)、分裂形成了具有無序結(jié)構(gòu)的愈傷組織時期。這個時期特征是細(xì)胞大小不再發(fā)生變化，愈傷組織表層的分裂逐漸減慢和停止，接著內(nèi)部組織細(xì)胞開始分裂，細(xì)胞數(shù)目進(jìn)一步增加。 二、愈傷組織的繼代培養(yǎng) 愈傷組織培養(yǎng)一段時間后必須轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上以保持培養(yǎng)物的繼續(xù)正常生長，更換一次培養(yǎng)基稱一代繼代培 養(yǎng) (subculture) 。 為什么要進(jìn)行繼代培養(yǎng)？ ? 經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)一段時間后，培養(yǎng)基里的養(yǎng)分耗盡 ? 培養(yǎng)基已干燥 ? 生長物已充滿培養(yǎng)瓶 ? 培養(yǎng)物需要擴(kuò)繁 ? 瓊脂培養(yǎng)基褐化或發(fā)黑 （因?yàn)橹参锝M織在培養(yǎng)前幾周有時會產(chǎn)生毒素物質(zhì)，這些物質(zhì)會擴(kuò)散進(jìn)入培養(yǎng)基） ? 需要讓培養(yǎng)物在一種新的營養(yǎng)條件下生長 27 ? 培養(yǎng)基由于植物材料的原因使 pH 降低，導(dǎo)致培養(yǎng)基液化 一般情況下，培養(yǎng)的愈傷組織需要每 4~6 周繼代一次。第一次繼代培養(yǎng)時用無菌刀片將新鮮愈傷切下，無菌地轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基上，被轉(zhuǎn)移的愈傷小塊 不宜過小，否則生長會受抑制。一旦愈傷建立起 來，多數(shù)愈傷系需要每月繼代一次。繼代時一般情況下不需改變原培養(yǎng)基的成分，但很多物種需要將生長素降低些，尤其是使用 2， 4D 時。 第二節(jié) 懸浮培養(yǎng) 懸浮培養(yǎng) (suspension culture)： 一般是把一些小塊生長旺盛的愈傷組織放入液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，從而使愈傷組織塊變成良好分散性的細(xì)胞和小的細(xì)胞聚集體。愈傷組織通過懸浮培養(yǎng)能產(chǎn)生大量的比較均一的細(xì)胞，而且細(xì)胞增殖速度快，適宜進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞的培養(yǎng)。 一、懸浮培養(yǎng)的用途 ? 提供一個相對一致的細(xì)胞群體（供生化研究、胚胎發(fā)生研究、胚的同步化研究等 ） ? 能快速吸收外源物質(zhì)，檢查藥效 ? 研究次生代謝、酶誘導(dǎo)、基因表達(dá)、抗生素的降解的良好實(shí)驗(yàn)體系 ? 多數(shù)懸浮細(xì)胞缺乏葉綠體、色素，對酶和次生物質(zhì)的分離及純化十分有利 ? 細(xì)胞增殖速度快，適于進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng) ? 分離原生質(zhì)體的良好細(xì)胞來源 28 二、從愈傷組織建立懸浮培養(yǎng)體系 多數(shù)懸浮培養(yǎng)物（ suspension cultures）是將生長快、質(zhì)地疏松的愈傷小塊轉(zhuǎn)移到與愈傷誘導(dǎo)含同樣成分的液體培養(yǎng)基里進(jìn)行振蕩培養(yǎng)而獲得。接種時必須有足夠多的細(xì)胞塊，以保證有較合適的細(xì)胞密度。振蕩速度一般為 30150rpm。第一次繼 代時，應(yīng)去掉開始時接入的大塊細(xì)胞團(tuán) ——過濾。有時有些物種的愈傷塊很堅(jiān)硬，接入液體培養(yǎng)基后不能分散，繼代幾次就會長出疏松愈傷。 三、懸浮培養(yǎng)物的繼代和生長情況檢測 比固體培養(yǎng)繼代時間短得多，一般每周或每兩周繼代一次。其方法是：培養(yǎng)瓶靜置一段時間后，用吸管吸去上清液，加入新鮮培養(yǎng)液。如果培養(yǎng)物過多，需要分瓶。 懸浮培養(yǎng)物的生長情況檢測可以通過下列參數(shù)確定： ? 細(xì)胞疊積體積（ packed cell volume， PCV） ? 細(xì)胞數(shù)（ cell number） ? 鮮、干重（ wet and dry weight） ? 蛋白質(zhì)和 /或 DNA 含量（ protein and/or DNA content） ? 培養(yǎng)基電導(dǎo)率（ medium conductivity） ? 細(xì)胞生活力（ cell viability） 29 第三節(jié) 愈傷組織分化與植株再生 體細(xì)胞胚胎發(fā)生： 指從體細(xì)胞進(jìn)行的類胚結(jié)構(gòu)的生產(chǎn)。體細(xì)胞胚是一個二極結(jié)構(gòu)，不物理地附著于原組織，每一個體細(xì)胞胚稱為胚狀體，它可以同合子胚一樣發(fā)育成植株。 器官發(fā)生： 指從愈傷組織形成芽及根的過程，芽是一個單極性結(jié)構(gòu)，物理地同母體組織聯(lián)結(jié)著。 一、 器官發(fā)生與植株再生 1. 器官發(fā)生與 植株再生的方式 在適合的激素濃度和配比及溫光條件下，愈傷組織細(xì)胞會發(fā)生生理代謝上的改變，促使細(xì)胞分裂部位和方向改變，首先出現(xiàn)分生細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞分裂逐漸形成分生細(xì)胞團(tuán)和分生組織，進(jìn)一步再分化形成維管結(jié)節(jié)直至分化成芽和根等器官。可以把愈傷組織分化出芽、根器官概括為以下幾種方式 ⑴單極分化：愈傷組織中的分生中心在刺激物質(zhì)的影響下向著一極分化，形成有根無芽或者有芽無根的現(xiàn)象。 ⑵雙極分化：愈傷組織中隨著細(xì)胞分裂出現(xiàn)兩個或兩個以上分生中心，其中有的分化芽，有的分化根，根芽之間并無輸導(dǎo)等組織溝通，在培 養(yǎng)瓶內(nèi)靠愈傷組織提供養(yǎng)料，這種以愈傷組織隔離著的芽和根的苗，常常不能移栽成活。 ⑶先芽后根：愈傷組織中產(chǎn)生多個分生細(xì)胞形成分生中心，從中僅分化出芽，一般情況下待芽長到一定大小時，切下移入生根培養(yǎng)基中，在其基部 30 即可分化出根。有些植物在分化芽的培養(yǎng)基上同時在芽器官基部分化出根，形成完整的植株。大多數(shù)植物均屬這類正常的分化途徑，這類苗移栽較易成活。 ⑷先根后芽：有些植物外植體脫分化后在愈傷組織上先分化出根，而后在靠近愈傷組織的根部上再分化出芽，有的將根切下放入分化培養(yǎng)基，再于根上分化出芽器官，甚至在根端也能分化出 芽。 2. 影響器官發(fā)生的因素 ? 化學(xué)因素 : 從早期煙草組織的研究我們知道 ,器官發(fā)生的表達(dá)可被外源化學(xué)物質(zhì)控制 ,高濃度的生長素和低濃度的分裂素可以促使細(xì)胞連續(xù)繁殖 ——無組織的生長。相反，高濃度的分裂素能引起莖 芽（ shootbud）形成。同時，auxion/cytokinin 之比值的變化成為特定的器官、根或芽分化的一個參數(shù)，一個基本的規(guī)律是：生長素促進(jìn)根分化，分裂素促進(jìn)芽分化。生長素與根形成有關(guān)，同時對于愈傷組織的保持也是必須的。在促進(jìn)芽的分化中， BAP是最有效的。 ? 物理因素 光：很多光 照條件下，一些植物均能進(jìn)行器官發(fā)生，說明光周期并不是非常重要的因子，可有的植物在光、暗交替條件下才能形成芽，而在連續(xù)光照下則不能。盡管如此，多數(shù)植物需要一個穩(wěn)定的光周期，多數(shù)培養(yǎng)條件是 1416h 光照， 810h 黑暗。光質(zhì)對于某些植物可能也很重要。 溫度：不同植物不一樣，需要摸索，如煙草和棉花就不一樣。 31 第四節(jié) 體細(xì)胞胚胎發(fā)生與植株再生 在離體組織細(xì)胞培養(yǎng)形成胚狀體的過程中，體細(xì)胞分裂增殖并順序通過原胚期，球形胚期，心形胚期，魚雷形胚期和子葉期五個時期，進(jìn)而形成完整的植株，與整體植物中受精卵的發(fā) 育過程極為相似。 一、植物胚狀體發(fā)生的普遍性 由于培養(yǎng)的植物組織細(xì)胞一般是體細(xì)胞，因而將由離體培養(yǎng)的組織細(xì)胞分化出的胚叫體細(xì)胞胚 (somatic embryo)；又由于離體培養(yǎng)的植物組織細(xì)胞是在未經(jīng)過有性過程的情況下直接產(chǎn)生胚這一結(jié)構(gòu)，并且形成的胚與性細(xì)胞形成的胚相似，因此也將此類胚稱為胚狀體（ embryoid）。 胚狀體發(fā)生在高等植物中是一個普遍現(xiàn)象，既包括雙子葉植物，也包括單子葉植物；既包括許多草本植物，也包括許多木本植物。產(chǎn)生胚狀體的離體培養(yǎng)物也是多種多樣的，離體的根、莖、葉、花芽、花藥、 幼苗、子葉、子房中的合子胚、胚狀體、多種單細(xì)胞、游離的小孢子以及原生質(zhì)體，都曾記錄過有直接或間接（ via callus）產(chǎn)生胚狀體的能力。 二、研究胚狀體的意義 ? 數(shù)量多。在細(xì)胞、愈傷組織和器官的培養(yǎng)中，一個培養(yǎng)物上誘導(dǎo)胚狀體的數(shù)量，往往比誘導(dǎo)芽的數(shù)量要多得多。 ? 速度快。胚狀體是從單細(xì)胞直接分化成小植株，而其它再生植株的方式，一般要經(jīng)過愈傷組織階段，時間上要慢得多。 32 ? 結(jié)構(gòu)完整。胚狀體一旦形成即可長成為小植株，成苗率高。 ? 是研究胚發(fā)育的良好材料體系。 ? 用于人工種子研究與生產(chǎn)，可節(jié)約大量種子，且可固定雜種優(yōu)勢。 三、胚狀體的概念與分類 胚狀體是植物組織培養(yǎng)中起源于非合子細(xì)胞，經(jīng)過胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育過程形成的胚狀結(jié)構(gòu)。這個定義包括下列幾點(diǎn)含義：① 胚狀體是組織培養(yǎng)的產(chǎn)物，只限于組織培養(yǎng)范圍使用，區(qū)別于無融合生殖的胚；② 胚狀體起源于非合子細(xì)胞，區(qū)別于合子胚；③ 胚狀體的形成經(jīng)歷胚胎發(fā)育的過程，區(qū)別于組織培養(yǎng)中分化的芽體。 胚狀體可按其來源分為兩大類：一類