0805園藝植物生物技術(shù)復(fù)習(xí)大綱、樣題及答案(2009)-資料下載頁
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【正文】 RFLP相比，AFLP不需要Southern轉(zhuǎn)移、分子雜交等步驟，故只需少量DNA，實驗結(jié)果穩(wěn)定可靠，信息量大。（2）AFLP主要的缺點(diǎn)：A、對基因組DNA和限制酶的質(zhì)量要求高，酶切不完全可能會出現(xiàn)假陽性。B、操作步驟較多，對實驗技能要求高，成本也較高。C、大多數(shù)為顯性標(biāo)記，難于鑒別等位基因。D、該技術(shù)已申請專利，只能用于非盈利性的科學(xué)研究。五、問答題（共2小題，每題7分，共14分）基因分離的常見途徑有哪些？答：（1）功能克隆法。利用已知功能的蛋白質(zhì)序列信息合成寡核苷酸探針從cDNA文庫或基因組文庫中篩選編碼基因或利用蛋白質(zhì)制成特異的抗體，從cDNA表達(dá)文庫中篩選相關(guān)的克隆。（2）圖位克隆法。圖位克隆法是利用分子標(biāo)記將基因定位到染色體的具體位置，再利用染色體步行或染色體登陸的方法逼近或找到目的基因的方法。包括目的基因的初步定位、基因組文庫構(gòu)建和篩選、目的基因區(qū)域跨疊克隆群的建立、目的基因精細(xì)定位及外顯子的分離、鑒定等步驟。（3）基于轉(zhuǎn)錄水平的差異表達(dá)分析。主要包括差異顯示、差減雜交以及抑制性差減雜交等具體的分離方法。（4）同源序列法。利用植物的種、屬之間，基因編碼序列的同源性大大高于非編碼區(qū)的原理，根據(jù)已知基因的序列可從另一種植物中分離類似功能基因。（5）轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法。利用轉(zhuǎn)座子可使插入位點(diǎn)基因失活產(chǎn)生突變體的原理來進(jìn)行基因定位與克隆的方法。該方法可以不需要事先知道基因的表達(dá)產(chǎn)物和表達(dá)特點(diǎn)而實現(xiàn)目的基因的分離。（6）TDNA標(biāo)簽法。利用TDNA整合到功能基因的內(nèi)部或者功能基因的調(diào)控區(qū)域，導(dǎo)致功能基因的失活產(chǎn)生各種不同的突變來進(jìn)行目的基因的分離。（7）基因芯片。將許多特定、已知的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地排列固定于支持物上，然后使其與待測的標(biāo)記樣品基因按堿基配對原理進(jìn)行雜交而實現(xiàn)目的基因的分離。如何對轉(zhuǎn)入植物基因組中的外源目的基因進(jìn)行檢測？答：（1）對轉(zhuǎn)入的目的基因序列片段進(jìn)行檢測。包括兩種手段：一是PCR方法檢測外源基因；二是用Southern雜交方法，以目的基因DNA為探針，檢測植物基因組中與其同源的部分。常見有Southern斑點(diǎn)雜交和Southern印跡雜交兩種。（2）轉(zhuǎn)入目的基因的RNA轉(zhuǎn)錄水平檢測。包括兩種方式：一是Northern雜交, 通過總RNA或mRNA與探針的雜交來分析；二是RTPCR，以植物總RNA或mRNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后經(jīng)PCR擴(kuò)增目的基因特異條帶。（3）外源基因表達(dá)蛋白的檢測。外源基因編碼蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中能夠正常表達(dá)并表現(xiàn)出應(yīng)有的功能乃是植物基因轉(zhuǎn)化的最終目的。外源基因表達(dá)蛋白檢測主要利用免疫學(xué)原理，主要采用ELISA檢測、Western雜交檢測。ELISA檢測程序包括抗體制備、抗體或抗原的包被、免疫反應(yīng)及檢出三個階段。Western雜交程序包括轉(zhuǎn)基因植株蛋白提取、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)條帶印跡、探針制備、雜交檢出五個步驟。8
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