【導讀】施全面質量管理，保證實驗質量。員，并明確了實驗室各項規(guī)章。因擴增與產物分析區(qū)。不得混用，須貼上不同標簽予以區(qū)別。，必須更換工作服，穿上鞋套。工作人員和研究生負責采集、接收標本。，將標本送入標本制備區(qū)。圾袋，將垃圾帶出實驗室由衛(wèi)生員統(tǒng)一送交醫(yī)院集中處理。，記錄紫外燈使用情況。劑，其余試劑要立即收好放回冰箱內。的詳細保存情況。在消毒有效期內。施康消毒液或類似消毒液的廢液缸中，還原實驗臺面。標識的記錄本、紙和筆。次性鞋套，戴手套，手套需常更換。、類型和標本數量。行加樣，加樣后低速6000rpm離心數秒后，將其放入傳遞窗。套置于專用污物桶中。，記錄結果，打印報告。，記錄儀器使用時間和運行狀態(tài)。，嚴格遵守操作規(guī)程。，嚴禁在實驗室內抽煙，吃零食。在科主任的監(jiān)督，由實驗室負責人領導下負責實施。,工作區(qū)域須穿工作服,離開時應換下。,并動作幅度盡量小。,不得吸煙，不得做與實驗無關的事。

　　

【正文】 ,取出搖勻 ,此為 2％瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時搖動 ,使 附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液。加熱時應蓋上封口膜 ,以減少水份蒸發(fā)。 ? 膠板的制備：將膠槽置于水平支持物上 ,插上樣品梳子。向冷卻至 5060℃的瓊脂糖膠液中加入 Goldview溶液 充分混勻， 61 倒膠時的溫度不可太低，否則凝固不均勻，速度也不可太快，否則容易出現(xiàn)氣泡。待膠完全凝固后撥出梳子 ,注意不要損傷梳底部的凝膠，然后向槽內加入 TBE 稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。因邊緣效應樣品槽附近會有一些隆起 ,阻礙緩沖液進入樣品槽中，所以要注意保證樣品槽中應注滿緩沖液。 瓊脂糖濃度的配置可參照下表 ： 瓊脂糖濃度 (%) 線型 DNA 分子的分離范圍 (Kb) 5～ 60 1～ 20 ～ 10 ～ 7 ～ 6 ～ 3 ～ 2 ? 樣品制備與加樣：溶解于 TBE或 THE內的樣品應含指示染料（ ％溴酚藍或桔黃橙）、蔗糖（ 10％ 15％）或甘油（ 5％ 10％），也可使用 ％ Ficoll增加比重，使樣品集中，每齒孔可加樣 510μ g。每次電泳應該加相應的Marker以判斷 PCR產物的分子量。 ? 電 泳：一般電壓為 515V/cm。對大分子的分離可用電壓 5V/cm。電泳過程最好在低溫條件下進行，電泳時間一般為 30分鐘。 ? 檢測：將電泳好的膠置于凝膠成像系統(tǒng)中用紫外光觀察電泳結果。 3. RNA 提取 ? 溶血：加 300ul 的肝素或 EDTA 二鈉抗凝的全血到含 RBC Lysis Solution 900ul 的 EP 管 , 室溫靜置 1min,期間，輕輕顛倒混勻 10次。 13000 ～16000 rpm 離心 20秒。棄上清液，將管底的白色沉淀用槍頭吹散，使白細胞在殘留的液體中懸浮。 ? 組織細胞：將凍存或新鮮的組 織，加入液氮讓組織塊完全冷凍，充分碾磨。 62 加入 1ml 的 TriZOL，分混勻，室溫靜置 5min。 ? 取 106~7細胞加入 1ml 的 TriZOL 中，充分混勻，室溫靜置 5min。 ? 再加入 200ul的氯仿，充分混勻，室溫靜置 5min。 4℃， 13000rpm 離心 15min。 ? 取上清液 500ul，加入等量的異丙醇。充分混勻室溫靜置 5min。 4℃， 13000rpm離心 10min。 ? 棄上清液，加入 75%的酒精 500ul， 4℃， 13000 rpm 離心 10 分鐘 。 (可將RNA 置于 70℃冰箱保存，最長時間不得超過一個月 ) ? 棄上清液， 加入 20ul 的 DEPC 水，混勻。 紫外分光光度計測定 OD260/280，比值大于 即可。 【 PCR檢測的項目和一般步驟】 RTPCR （ 15ug） RNA加入含 RTmix 16ul 的 EP管中，高速離心 10秒 → 65℃ 5分鐘→冰浴 →加 MMLV → 37℃ 60分鐘， 70℃ 10分鐘， RTmix （ 4 dNTPs, random primer ,5 buffer, RNA out, DTT） (Invitrogen公司產品 ) actin 為內參照檢測逆轉錄 的每一個標本是否成功 引物序列： 5’ GACTACCTCATGAAGATC3 5’ GATCCACATCTGCTGGAA3’ 加 2ul的 cDNA入含 23ul 的 PCRmix 中， 94℃ 5分鐘 → 94℃ 1分鐘 58℃ 1分鐘 72℃ 1分鐘， 共擴增 30 個循環(huán) → 72℃ 10分鐘 （ PCR 反應體系 25μl ，含cDNA 模板 ， 10 buffer 2. 5μl ， mmol/L MgCl2 ， 4 dNTPs ，引物各為 20 pmol ， Taq DNA 聚合酶 1 U 。 ） (Promega 公司產 品 ) 電泳條帶： 500bp 63 二十 五 、 ABI 7500 型核酸擴增熒光檢測儀操作維護及分析程序 1. 目 的： 保證 ABI 7500 型擴增儀正常運轉，性能穩(wěn)定，保證擴增及結果分析的標準化和準確率。 2. 適用范圍 : ABI 7500 型擴增儀 3. 操作人員 : 鄭建建 等。 4. 系統(tǒng)維護 微軟 Windows XP 操作系統(tǒng)的維護 硬盤驅動器每月 29 日運行一次碎片清除程序，使用 Norton Utilities或類似軟件?，F(xiàn)以 Norton為例： 放入 Norton Utilities光盤，運行 Setup文件。 安裝完后取出 Norton Utilities光盤，重新啟動計算機。 運行 Norton Utilities 軟件，并啟動其清理碎片 /優(yōu)化程序。 運行完成后，檢查以確信無嚴重錯誤記錄，退出 Norton Utilities。 以后每次只需運行 Norton Utilities 軟件中的清理碎片 /優(yōu)化程序。 64 7500擴增儀的維護 樣品槽的清潔 樣品槽每月 29 日左右進行一次清潔，如出現(xiàn) 樣品槽污染情況則隨時清潔。 運行 25℃ HOLD 程序使樣品槽溫度達到室溫。關閉儀器，等待 10 分鐘。 從樣品槽移去樣品架。 在樣品槽中加入少量 95％乙醇，用尼龍棉簽或塑料桿擦洗反應孔。 用干棉簽吸干乙醇。 確保 7500 光源檢測器未蓋住樣品槽時 ,打開 PCR 儀，并升溫到 50℃運行 10分鐘，以蒸發(fā)掉多余的乙醇。 7500光路系統(tǒng)的維護 校正 ROIs 在 7500 系統(tǒng)得到任何結果之前，必須校正增益范圍（ ROIs），應該按 照如下步驟校正新的增益范圍數值。不得由一般實驗人員進行該項操作。 從 Instrument菜單選擇 Calibrate。 在 ROI Inspector 窗口中選 Display Properties。 在 4000，確定 Show Saturation已被選中， OK。 在 Capture Image From 中選 Filter A，曝光時間為 256ms， 65 Snapshot。 檢查圖像飽和度。若曝光時間為 256ms 時拍攝的圖像中沒有過飽和的提 示，增加曝光時間并再次 Snapshot，直至圖像中出現(xiàn)過飽和，然后將曝光時間往回調。 如果所選曝光時間適宜，并且圖像中樣品孔亮度充分又無任何飽和出現(xiàn)，單擊 Generate Calibration 按鈕。 如果圖像中所有樣品孔 ROIs 亮度充分，綠色光圈將會出現(xiàn)在每一個反應管區(qū)域周圍。如果 ROIs 不能校正，重復 e～ f步。 單擊 Save Calibration。這樣可保存濾光片 A新產生的 ROI校正數值。 ROI Inspector 窗口中， Masks Loaded 欄的Filter A 后會顯示“ OK”。 對其它三個濾光片重復 b～ h 步。當完成后，在 ROI Inspector窗口中點擊 Done。 如果圖像中 ROIs 亮度不充分或過飽和，將會有一條錯誤信息提示。選擇更適宜的曝光時間并再產生校正數值，直至ROIs 被校正合適。 檢查樣品槽的熒光污染 檢查樣品槽的熒光污染每月 29 日進行一次，如有需要隨時進行。 開啟 ABI PRISM 7500 型核酸擴增熒光檢測儀電源。 66 從 Start 菜 單或桌面點選運行 ABI PRISM 7500 SDS 軟件。 。 7500 儀器滑門向前滑移蓋住樣品槽，并關緊。 用 FAM 濾光片，打開 ROI Inspector 窗口，曝光時間設為2048ms。 觀察 96 孔中背景熒光。如孔有顯著熒光則表示該孔存在熒光污染。 測定一個合乎標準的背景熒光水平。①推開 7500 型核酸擴增熒光檢測儀滑門，鎖定。 ②將一塊新且干凈的空樣品板不帶蓋的放入樣品槽。③前推滑門解鎖，滑下關閉。④設置曝 光時間為 2048ms，照像。 ，依照 “樣品槽的清潔”中的方法清洗它們。清洗后按照以上 ～ 檢查樣品孔。 更換鹵素燈 儀器使用大約 2020小時后應更換鹵素燈。 關閉儀器，冷卻 15 分鐘。 將樣品板放入儀器樣品槽，關閉滑門。在儀器的頂部向上打開燈艙門。 擰下固定燈罩的螺絲，將燈罩向前滑移，使其從設備上取下。 將舊燈泡向前滑移，使其從夾狀支架上取下，并將燈泡從燈座上拔下。 67 把新燈泡尾部的插桿插入燈座上的插孔，使二者連接起來。 使燈的長軸與儀器前向平行（即豎直于地面），將新燈泡滑回燈位。 在燈艙門處于打開狀態(tài)下，打開儀器，確證在儀器運行時燈也能打開。 蓋上燈罩，擰緊螺絲，關上燈艙門。 若新鹵素燈不工作， 7500 型核酸擴增熒光檢測儀電源保險絲可能有問題。 校準 ABI PRISM 7500 型核酸擴增熒光檢測儀為復雜精密儀器，其校準工作需由專業(yè)工程 師進行。實驗室應與儀器廠家達成協(xié)議，定期校準儀器。 平時 通過對室內質控圖的分析，發(fā)現(xiàn)實驗結果出現(xiàn)系統(tǒng)誤差后，又經過分析排除了 試劑和人員誤差，應懷疑是否儀器出現(xiàn)了檢測偏差從而需要校準。 實驗室人員根據上述“光路系統(tǒng)的維護”部分的內容調節(jié)光路，可初步確定儀器是否光路原因引起的檢測偏差，通過光路調節(jié)解決問題。若問題不出在光路系統(tǒng)，則應聯(lián)系儀器廠家派技術人員來進行校準。 附：注意事項 a） 儀器應放置在水平堅固的平臺上，外界電源系統(tǒng)電壓要匹配，并要求有良好的接地線。 b） 環(huán)境溫度保持 68 在 23℃左右，濕度保持在 60％左右。 c） 儀器應配備功率≥3000W 的穩(wěn)壓器。 d） 儀器應定 期清潔維護。 e） 儀器使用時應嚴格遵守上述 使用步驟。 5 擴增分析程序 核酸擴增標準程序 擴增反應前須先在 7500 SDS 軟件的設置面板上按照事先排好的標本位置進行設置。每次實驗除了待檢標本，還要包括一個陰性對照、一個陽性對照、一個陽性室內質控品、一組陽性標準品（ 5 個梯度 10 10 10 10 102）。 檢查電腦與儀器的聯(lián)線是否正常，電腦應處于外接電源供電狀態(tài)。 依次打開電腦顯示器和電腦主機的電源開關，進入 Windows XP 界面。 接著打開 PCR儀電源 開關，預熱 5分鐘。 雙擊 ABI PRISM 7500 SDS Software 圖標，打開軟件。 從 File 菜單中選擇 New，在 New Document 窗口中，在 Assay菜單中選擇 Absolute Quantitation，打開一空白設置面板。 在 Detector Manager 窗口里新建并添加 detector 到 Well Inspector中。 在 Well Inspector 窗口中設定樣品種類與名稱，數量。 點選此 detector前的 Use 選框。 在 Task 欄中選擇樣品種類： Standard－陽性標準品梯度， 69 NTC－陰性對照 Unknow－未知樣品 再在 Sample Name 欄中依次輸入樣品名稱。 在 Quantity 欄中，輸入陽性標準品的數量值（如 10000、100000）。 點 Instrument 可在此頁面設定熱循環(huán)參數。 檢查設置正確與否。 在 File 菜單中的選 Save，在彈出的對話框中的 File Name欄 里輸入文件 名，點擊 Save。 運行程序： a） 在設置完程序文件的 Instrument 頁面，點Start 鍵，即可運行。 b） 反應結束后，點選 File中的 Save，保存實驗結果。 結果分析標準程序 對于 7500 結果曲線的分析，應按以下步驟進行：全部曲線 —— 陰性對照 —— 陽性對照 —— 陽性室內質控品 —— 陽性標準品 —— 逐個分析（標出陽性標本和可疑標本） —— 調整參數，獲得較好的標準曲線，顯示定量結果 —— 登記，發(fā)報告。 整體曲線的觀察 :將所有曲線選中進行整體觀察。 a） 觀察是否存在污染情 況（包括標本污染和試劑污染），特別應注意大量曲線在同一 Ct 值出現(xiàn)上漲的情況。 b） 觀察是否有光路傳導阻滯或電壓波動等機器原因形成的異常曲線。 70 陰性對照的分析。陰性對照：試劑中加入與待檢標本進行同樣處理的已知陰性標本。 作用：用以監(jiān)測實驗室和前處理過程中是否存在污染。 陽性對照的分析。陽性對照：試劑中加入與待檢標本進行同樣處理的已知陽性標本。 用以監(jiān)測實驗能否正常檢出陽性標本，避免假陰性的出現(xiàn)。 陽性室內質控品的分析。 陽性室內質控品：試劑中加入與待檢標本進行同樣處理的已 知或未知濃度的陽性室內質控血清。用以監(jiān)控日常實驗的精密度。 陽性標準品的分析。 a） 各梯度曲線的分布是否均勻，若各梯度曲線均未分開，則表明陽模稀釋可能存在問題，提示實驗中存在較大人為誤差。 b） 觀察各曲線的 Ct 值