【導(dǎo)讀】苷的測(cè)定、植物黃酮類物質(zhì)的提取與檢測(cè)、功能性食品設(shè)計(jì)等實(shí)驗(yàn)。為主要原料的保健食品中紅景天苷的含量進(jìn)行微量測(cè)定，紅景天苷的最低檢出量為g；黃曉鈺，劉鄰渭。袁黎明，制備色譜技術(shù)及應(yīng)用。宋曉凱，吳立軍。北京，化學(xué)工業(yè)出版社，2020，8。保健食品功效成分檢測(cè)方法。生加深對(duì)基礎(chǔ)理論知識(shí)的深入理解，并提高學(xué)生的實(shí)際操作技能和對(duì)數(shù)據(jù)的歸納分析能力。制品)、乳制品、各類水果蔬菜、果汁等食品中超氧化物歧化酶活性的測(cè)定。在電子供體如甲硫氨酸存在下，核黃素受光激發(fā)，與電子供體反應(yīng)被還原。緩沖液的量為所用樣品的10倍以上，在4℃條件下或冰浴中研磨成勻漿，四層紗布過濾，反應(yīng)小室壁上貼錫箔紙，應(yīng)將每個(gè)試管擺放在照光后所接受光強(qiáng)一致的位置。入25—30μL酶液。以抑制藍(lán)色形成的50％為一個(gè)酶活單位。進(jìn)行比色測(cè)定時(shí)，應(yīng)用未加核黃素的酶反應(yīng)體系液作空白。酶液的制備：除使用以上K2HP04—KH2P04緩沖液外，其他同氮藍(lán)四唑法。

　　

【正文】 雙向 PPC 展開時(shí)常常出現(xiàn)在特定的區(qū)域，據(jù)此可推測(cè)它們的結(jié)構(gòu)類型，判定是否成苷以及含糖數(shù)量。 2. 薄層色譜（ TLC）法在黃酮類化合物鑒定中的應(yīng)用 TLC 用于黃酮類化合物的鑒定也日趨廣泛。一般采用吸附薄層色譜，常用的吸附劑有硅膠與聚酰胺，其次是纖維素。 (1)硅膠薄層色譜 用于分離與鑒定弱極性黃酮類化合物較好。分離黃酮苷元常用的展開劑是甲苯 甲酸甲酯 甲酸（ 5： 4： 1），并可以根據(jù)待分離成分極性的大小適當(dāng)?shù)卣{(diào)整甲苯與甲酸的比例。另外尚有苯 甲醇（ 95： 5）、苯 甲醇 乙酸（ 35： 5： 5）、氯仿 甲醇（ ：， 7： ）、甲苯 氯仿 丙酮（ 40： 25： 35）、丁醇 吡啶 甲酸（ 40： 10： 2）等。分離黃酮苷元的衍生物如甲醚或乙酸乙酯等中性成分，可用苯 丙酮（ 9： 1）、苯 乙酸乙酯（ ： ）等為展開劑。 (2)聚酰胺薄層色譜 適用范圍較廣，特別適合于分離含游離酚羥基的黃酮及其苷類。由于聚酰胺對(duì)黃酮類化合物吸附能力較強(qiáng)，因而展開劑需要較強(qiáng)的極性。在大多數(shù)展開劑中含有醇、酸或水。常用的展開劑有乙醇 水（ 3： 2）、水 乙醇 乙酰丙酮（ 4： 2： 1）、水 乙醇甲酸 乙酰丙酮（ 5： ： l： ）、水飽和的正丁醇 乙酸（ 100： 1， 100： 2）、丙酮 水（ 1：1）、丙酮 95％乙醇 水（ 2： 1： 2）， 95％乙醇 乙酸（ 100： 2），苯 甲醇 丁酮（ 60： 20： 20）等。 20 世紀(jì) 60 年代，國外有人介紹一些黃酮苷元和黃酮苷用硅膠、 聚酰胺與纖維素 3 種薄層色譜和 4 種混合溶劑作為展開劑所得到的 hRf值，可供參考。 （三）黃酮含量測(cè)定方法 1．總黃酮的測(cè)定方法 (分光光度法 ) 本方法適用于各類食品中總黃酮的測(cè)定。 本方法總黃酮最低檢出限為 。／ mL。 1． 1 方法提要 黃酮類化合物 (Flavonoids)是具有苯駢毗喃環(huán)結(jié)構(gòu)的一類天然化合物的總稱， 一般都具有 4 位羰基，且呈現(xiàn)黃色。黃酮類化合物多分布于植物中，大多數(shù)以苷的形式存在。黃酮類 20 化合物中的 3羥基、 4羥基或 5羥基、 4羰基或鄰二位酚羥基，與鋁鹽進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)，在堿性條件下生成紅色的絡(luò)合物。 本方法對(duì)樣品中黃酮類化合物進(jìn)行提取純化后，用分光光度法于 510nm 波長下測(cè)定其吸光度，與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品比較，進(jìn)行侍測(cè)物中總黃酮的定量測(cè)定。 1． 2 儀器：分光光度計(jì)，恒溫水浴箱， 真空泵，鹽基交換管等。 1． 3 試劑 (1)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 (Rutin，美國 Sigma 公司 )，亞硝酸鈉 (分析純 )、硝酸鋁 (分析純 )、氯仿 (分析純 )、無水乙醇 (分析純 )、氫氧化鈉 (分析純 )、甲醇 (分析純 )、聚酰胺樹脂 (6080 目 )；水為去離子水。 (2)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取經(jīng) 105℃ 干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 ，加甲醇溶解并定容至 100mL，配成 15μ g/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。 1． 4 測(cè)定步驟 (1)樣品處理： a．固體樣品：稱取 1— 2g 干燥的固體樣品，用濾紙包緊，置于平底燒瓶中，加入 50～l00mL70％乙醇溶液，浸潤后，在 80℃ 水浴下回流 2h，至黃酮類化合物基本提取完全。粗提液冷卻后，減壓 抽濾，并用少量 25％乙醇溶液洗滌濾渣，合并濾液。在 50℃下減壓蒸餾，除去其中的乙醇，直至燒瓶內(nèi)溶液呈無醇味。倒出燒瓶內(nèi)溶液，并用 30mL 熱水分 3 次洗滌燒瓶，抽濾后，將濾液倒人分液漏斗中，以 75mL 氯仿分 3 次萃取脫脂。待完全分層后，收集各次下層水溶液并定容至 50mL。 稱取 1～ 2g 經(jīng)預(yù)處理的聚酰胺樹脂粉末，濕法裝柱，用水飽和。吸取上述脫脂后的水溶液 1～ 2mL，沿層析柱慢慢滴入柱內(nèi)，放置一定時(shí)間，待測(cè)液被充分吸附后，用 70％乙醇或甲醇洗脫，流速為 ／ min，至流出液基本無色，一般收集 l0mL 即可 。上述洗出液用洗脫劑定容后即可用于測(cè)定。 b．液體樣品：準(zhǔn)確吸取樣品 ，定容至 50mL 后，直接以 75mL 氯仿分 3 次萃取脫脂，其余步驟同上。 (2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、 、 、 、 、 ，相當(dāng)于蘆丁 0、 7 150、 300、 450、 600μ g 移入 l0mL 刻度比色管中，加入 30％乙醇液至 5mL，各加 5％亞硝酸鈉溶液 ，振搖后放置 5min，加入 10％硝酸鋁溶液 搖勻后放置6min，加 ／ L 氫氧化鈉溶液 2mL，用 30％乙醇定容至刻度，以零管為空白，搖勻后用 lcm 的比色杯，在 510nm 處測(cè)定吸光度，繪制蘆丁含量 (μ g)與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 (3)樣品測(cè)定：根據(jù)樣品中總黃酮含量高低，取適宜體積待測(cè)液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備操作步驟于 510nm 處進(jìn)行吸光度的測(cè)定 (樣液如有沉淀，應(yīng)過濾后測(cè)定 )。 蘆丁濃度為 ～ ，以最小二乘法計(jì)算，其回歸方程 21 為： y=， r=。 1． 5 結(jié)果計(jì)算 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，求出相當(dāng)于試樣吸光度的蘆丁含 量，按下式求出總黃酮含量： 式中 X—— 樣品總黃酮含量 (g／ l00g 或 g／ l00mL)； mi—— 依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樁測(cè)液中黃酮含量 (μ g)； m—— 試樣的質(zhì)量或體積 (g 或 mL)； v1—— 待測(cè)液分取的體積 (mL)； v2—— 待測(cè)液的總體積 (mL)。 注：結(jié)果精確到小數(shù)點(diǎn)后兩位。 1． 6 注釋 (1)方法精密度：對(duì)同一樣品在相同條件下，重復(fù)測(cè)定 6 次，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為 ％。 (2)方法回收：對(duì)總黃酮含量為 ％的減肥茶加入相似濃度 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行回收試驗(yàn)，其平均添加回收率為 ％。 (3)對(duì)于含葡萄、山楂等有色水果為原料的樣品，可用未加鋁鹽試劑的樣液為空白或采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行測(cè)定，以避免樣液顏色對(duì)測(cè)定干擾而引起結(jié)果偏高。 2．蘆丁的測(cè)定方法（高效液相色譜法） 本方法適用于植物類食品中蘆丁的測(cè)定。 本方法蘆丁的最低檢出限為 20μ g。 2． 1 方法提要 蘆丁為黃酮類化合物的一種，結(jié)構(gòu)為槲皮素 3O蕓香糖，植物類樣品用石油醚脫脂后，經(jīng)甲醇加熱回流提取蘆丁，以反相高效液相色譜法分離，在紫外檢測(cè)器 350nm 條 件下，以保留時(shí)間定性、峰面積定量。 2． 2 儀器 （五）主要儀器設(shè)備 (1)LC4A 高效液相色譜儀， CRIB 色譜處理機(jī)。 (2)檢測(cè)器 (SPD2AS 紫外檢測(cè)器 )。 (3)索氏提取器。 (4)層析柱。 (5)微孔過濾器 (濾膜 )。 2． 3 試劑 (1)甲醇 (色譜純 )。 22 (2)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 (Rutin，美國 Sigma 公司 )。 (3)石油醚 (6090℃ )。 (4)水為重蒸水。 (5)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取在 105℃ 干燥 至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 10mg 于 100mL 棕色容量瓶中。用無水乙醇溶解后定容至刻度，配成 ／ m L 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。 2． 4 測(cè)定步驟 (1)樣品制備： a．固體樣品：準(zhǔn)確稱取 粉末樣品于索氏提取器中，用石油醚 (60～ 90)提取脂肪等脂溶性成分，棄去石油醚提取液，剩余物經(jīng)揮去石油醚，再以甲醇加熱回流提取 并定容，微孔濾膜 ( m)濾過后供測(cè)定樣品含量用。 b．液體樣品：準(zhǔn)確吸取樣品 ，直接以石油醚萃取脫脂，揮去石油醚后，以甲醇溶解并定容，經(jīng)微孔濾膜 ( m)濾過后供測(cè)定用。 (2)色譜分離條件： 色譜柱： Shim－ pact CLCODS， 6mmxl50mm， 5μ m。 流動(dòng)相：甲醇 水 (55： 45)，以磷酸調(diào) pH 至 ，臨用前用超聲波除氣。 流 速： ／ min。 柱 溫： 40℃。 檢測(cè)波長： UV350nm。 靈敏度： 。 進(jìn)樣量： 10μ L。 (3)樣品測(cè)定準(zhǔn)確吸取樣品處理液和標(biāo)準(zhǔn)液各 10μ L，注入高效液相色譜儀進(jìn)行分離，以其標(biāo)準(zhǔn)溶液峰的保留時(shí)間定性 ，以其峰面積計(jì)算出樣液中被測(cè)物質(zhì)的含量： 式中 x—— 樣品中蘆丁含量 (mg／ g)； S1—— 樣品峰面積； c—— 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度 (mg／ mL)； S2標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積； v—— 樣品定容體積 (mL)； m—— 試樣質(zhì)量 (g)。 2． 6 注釋 23 (1)本法在蘆丁濃度為 2～ 10μ g／ mL 范圍內(nèi)呈直線關(guān)系，以最小二乘法計(jì)算，其回歸方程為： y=593766x+67420， r=。 (2)精密度：對(duì)同一樣品在上述條件下重復(fù)測(cè)定 6 次，其相 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差 (RSD)為 3％。 (3)回收率：樣品中加入相似濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行回收試驗(yàn)。其添加回收率為 ％～％。 實(shí)驗(yàn)五：功能性食品設(shè)計(jì)與制作 綜合運(yùn)用所學(xué)的功能性食品學(xué)、食品營養(yǎng)學(xué)、食品化學(xué)、食品工藝學(xué)等多學(xué)科知識(shí)，結(jié)合市場(chǎng)需求狀況和實(shí)驗(yàn)室操作條件，理論設(shè)計(jì)并實(shí)際制作一種功能性食品。