【正文】 /6/3 張星元：發(fā)酵原理 132 ① 剛性節(jié)點（ rigid node）： 抵抗分流比改變的節(jié)點。 如果某節(jié)點處的分流比受到該處的一條或多條支路嚴格的控制，這樣的節(jié)點被稱為剛性節(jié)點。 這種控制往往是通過反饋控制和交叉激活兩種機制的聯(lián)合作用來實現(xiàn)的。所謂聯(lián)合作用，是指各個分支途徑自身的反饋控制和與之競爭原料的分支途徑的產(chǎn)物對它的交叉激活，兩種機制一起發(fā)生作用。剛性節(jié)點處的分流比不易發(fā)生改變，因為與節(jié)點相關(guān)的各種酶均存在 特定的動力學(xué)關(guān)系 。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 133 ② 撓性節(jié)點（ flexible node）： 屈服于分流比改變的節(jié)點。 在此類節(jié)點處的分流比容易根據(jù)細胞代謝的需求做出響應(yīng) ，即容易做出相應(yīng)的改變。 從這些節(jié)點出發(fā)的互相競爭的分支途徑的第一個酶，對節(jié)點（酶的底物）有類似的底物親和力，有類似的酶反應(yīng)速率。撓性節(jié)點不限制分支途徑的產(chǎn)物得率，因為無論何時只要需要，任何分支途徑的分流比都可能在 0～ 100%范圍變動，因此 撓性節(jié)點是最“ 順從”的（上圖右半部分） 。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 134 ③弱剛性節(jié)點（ weakly rigid node）：性能上處于前述兩種節(jié)點之間的節(jié)點原則上都屬于弱剛性節(jié)點。嚴格地說，如果一個節(jié)點的分流比主要取決于一條分支途徑的動力學(xué)（即構(gòu)成分支途徑的所有酶的整體響應(yīng)），這樣的節(jié)點叫做弱剛性節(jié)點。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 135 弱剛性節(jié)點的分流比由一個分支途徑（優(yōu)勢分支）控制 ，這可能是由于優(yōu)勢分支途徑的第一個酶具有較高的比活力和（或）較高的底物（節(jié)點）親和力，并且不受反饋抑制；即使從屬分支（假定是流向產(chǎn)物的分支）解除調(diào)節(jié)，還是有相當大的一部分流量依然進入優(yōu)勢分支，從而限制產(chǎn)物得率的上升。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 136 弱剛性節(jié)點與撓性節(jié)點有如下不同：一條分支途徑與另一條（一些）分支途徑相比，占有明顯的優(yōu)勢。 這是由于優(yōu)勢分支途徑的酶對共同代謝物（節(jié)點）有更大的親和力，并且（或者）優(yōu)勢分支途徑的酶比從屬的分支途徑的酶有更大的整體活性。在這種情況下，完全解除從屬分支途徑的調(diào)節(jié)，也不會對流量有什么顯著的影響。另一方面，如果優(yōu)勢分支途徑的活性被減弱，就會顯著增加流入從屬分支途徑的流量。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 137 強剛性節(jié)點是被終端產(chǎn)物激活或抑制高度調(diào)控（上圖左半部分） 。在這個例子中，每個產(chǎn)物代謝物作為其競爭分支途徑的激活劑，同時又作為其自己合成途徑的抑制劑。反饋抑制總是施加在催化途徑第一步反應(yīng)的酶上。 剛性節(jié)點對途徑的產(chǎn)物得率施加控制性的影響，它的解除調(diào)節(jié)比酶學(xué)的弱化可能更為復(fù)雜。 因此在應(yīng)用“五字策略”制訂育種的具體方案時應(yīng)盡量采用解除調(diào)節(jié)的育種手段。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 138 假定目標是增加 P1分支的分流比，而且，在沒有激活劑 P2存在時， P1的穩(wěn)態(tài)濃度（ steady state concentration） 高得足以抑制它本身的合成。在這種情況下，增加P1 分支途徑的分流比就會減弱流向 P2的流量。然而，對于強剛性節(jié)點，這種做法將導(dǎo)致 P2的低水平，所以 P1 分支途徑將會喪失 P2對它的激活作用。簡單地說，一條分支途徑的弱化導(dǎo)致其競爭分支途徑的弱化，結(jié)果是整個 節(jié)點崩潰（ collapse ） ， 每條分支途徑的分流比相對來說沒有改變。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 139 因為復(fù)雜、多樣的控制結(jié)構(gòu)和酶動力學(xué)，代謝網(wǎng)絡(luò)并不總是呈現(xiàn)上述分類所暗示的對于流量分配的二元響應(yīng) 。 因此，強剛性節(jié)點的一條分支途徑的弱化可能僅僅導(dǎo)致與它競爭的分支途徑的部分弱化，以致有可能 在包含一個剛性節(jié)點的依賴型網(wǎng)絡(luò) （ dependent work ） 中實現(xiàn)產(chǎn)物得率改進。也有可能因為弱化無用的途徑而引起中間代謝物的分泌，而不是流量的降低或代謝流的方向的改變。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 140 盡管其他可能的控制結(jié)構(gòu)也可能產(chǎn)生一個剛性節(jié)點，任何此類控制的關(guān)鍵問題是，在互相競爭的分支途徑之間存在一個反饋（相互影響）機制，以維持分流比恒定的趨勢。剛性節(jié)點不僅能限制產(chǎn)物得率，而且通過 簡單的 酶活性弱化不容易減輕這種作用。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 141 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 142 上圖所示的異檸檬酸節(jié)點是一個已經(jīng)過全面研究的代謝分支點。當細胞在醋酸鹽基質(zhì)上生長時，異檸檬酸裂合酶（ IL） 被誘導(dǎo)； 醋酸鹽在碳架物質(zhì)的回補方面起重要作用，否則碳架物質(zhì)就會在 TCA循環(huán)中以 CO2的形式丟失。 當在醋酸鹽基質(zhì)上生長時，異檸檬酸脫氫酶（ IDH） 主要處于磷酸化狀態(tài)（大約 80%），在這種狀態(tài)下該酶沒有活性。當給予細胞更有利的碳源時，如葡萄糖， IDH就會迅速脫磷酸而被激活。 這是共價調(diào)節(jié)的一個典型例子。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 143 上圖概括了在 乙酸鹽上生長時，兩種互相競爭酶的動力學(xué) 參數(shù)。該分支點的一個重要特征是各自的 Km 值差別極大，異檸檬酸裂合酶（ IL） 的 Km 值是異檸檬酸脫氫酶（ IDH ） 的 75倍。在異檸檬酸生理濃度時（ 約 160μmolL1）， IL 催化的反應(yīng)是關(guān)于異檸檬酸的一級反應(yīng)，而 IDH 則已被共同底物異檸檬酸所飽和。因為這兩種酶的動力學(xué)的相互控制，通過該支路的流量對異檸檬酸濃度水平的變化極端敏感。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 144 若向乙酸基質(zhì)中生長的培養(yǎng)物中加入葡萄糖，不僅能使 IDH 的 vmax提高（ 葡萄糖可使 IDH 的 vmax增加 5 倍） ，同時通過檸檬酸裂合酶的碳流的相應(yīng)減少，其總結(jié)果是胞內(nèi)異檸檬酸水平降低（大約 170 倍）。 因為與IDH 相比， IL 對異檸檬酸有一個顯著高的 Km ， 所以異檸檬酸濃度的下降使通過該支路的流量有一個很大程度（約 99%）的減少。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 145 因此，雖然沒有任何已知的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑直接作用于 IL， 通過它的流量可從總量的 30% 下降到實際上的 0。這種控制很有趣的特性是，最受影響的酶 IL 沒有受到直接控制。這種現(xiàn)象已經(jīng)被稱作 分支點效應(yīng) 。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 146 代謝網(wǎng)絡(luò)與亞網(wǎng)絡(luò) 代謝網(wǎng)絡(luò)的包含 2 個以上節(jié)點的任何部分，都可以稱為該代謝網(wǎng)絡(luò)的亞網(wǎng)絡(luò)。 代謝網(wǎng)絡(luò)和亞網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)可以抽象為兩個基本類型： 獨立型亞網(wǎng)絡(luò) 和依賴型亞網(wǎng)絡(luò) 。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 147 S B P 1 2 S B1 B2 P 依賴型亞網(wǎng)絡(luò) 獨立型亞網(wǎng)絡(luò) S基質(zhì) P目的產(chǎn)物 B副產(chǎn)物 節(jié)點 1 2 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 148 依賴型亞網(wǎng)絡(luò)： 亞網(wǎng)絡(luò)中的每個節(jié)點向終端產(chǎn)物貢獻一個 按化學(xué)計量 消耗的組成部分；所有分支的流量必須達到化學(xué)計量平衡，以防胞內(nèi)代謝中間物的累積和分泌。若要提高產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率兩個節(jié)點的流量分配都必須改變，兩個節(jié)點的重要性相同。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 149 獨立型亞網(wǎng)絡(luò)： 亞網(wǎng)絡(luò)的主要節(jié)點不是以按比例縮合的方式形成產(chǎn)物，改變?nèi)魏我粋€節(jié)點上的流量分配就有可能提高產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率，但節(jié)點的重要性不同。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 150 代謝網(wǎng)絡(luò)中包含大量的節(jié)點，一般認為只有相當少的節(jié)點，其分流比實際上影響目的產(chǎn)物得率，這些節(jié)點稱 為主要節(jié)點 （ principal node ） 。網(wǎng)絡(luò)的剛性程度取決于主要節(jié)點的性質(zhì)及其在網(wǎng)絡(luò)中的分布。 不論在獨立型還是依賴型的代謝網(wǎng)絡(luò)中， 網(wǎng)絡(luò)的剛性程度最終取決于將主節(jié)點的流量分布從適于生存競爭變成適于目的產(chǎn)物形成的難易程度。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 151 代謝工程與五字策略 的互補性 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 152 微生物生物工程基本理論已對代謝流及其控制作了定性或半定量的分析，并在此基礎(chǔ)上建立了代謝導(dǎo)向的五字策略。這就為代謝流（及其控制）的定量分析架起了橋梁。為發(fā)酵工程研究人員和技術(shù)人員學(xué)習(xí)和應(yīng)用代謝工程的代謝分析和綜合技術(shù)打好了理論基礎(chǔ)。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 153 代謝工程是這樣一種生物工程技術(shù)： 在對代謝流及其控制進行定量分析的基礎(chǔ)上，提出精確的遺傳修飾方案，并借助分子生物學(xué)技術(shù)付諸實施。如此按部就班反復(fù)進行實踐，從代謝的整體上改善細胞的性能和應(yīng)用前景。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 154 五字策略的統(tǒng)籌方法對代謝工程育種有宏觀指導(dǎo)意義，但五字策略是建立在人一廂情愿的基礎(chǔ)上的統(tǒng)籌策略。按五字策略制定育種方案時，盡管是以從原料到產(chǎn)物的載流路徑及其調(diào)節(jié)機制為依據(jù)的，但一般并沒有把節(jié)點剛性的因素考慮在內(nèi)；在實施時也就不可能完全達到預(yù)期目標。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 155 對于流經(jīng)剛性節(jié)點的代謝流，僅僅改變該節(jié)點下游的反應(yīng)的酶水平或活性的，是不可能對代謝流進行順利導(dǎo)向的。如果目標節(jié)點為撓性節(jié)點或弱剛性節(jié)點 ， 則可放心按 應(yīng)用五字策略制訂育種 方案進行相應(yīng)的遺傳操作，因為撓性節(jié)點對代謝流的導(dǎo)向是最順從的。考慮到可能存在剛性節(jié)點， 在應(yīng)用五字策略制訂育種的具體方案時應(yīng)盡量采用解除調(diào)節(jié)的育種手段。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 156 代謝途徑分析以及基于這些分析所進行的分子遺傳學(xué)操作，必須把代謝網(wǎng)絡(luò)節(jié)點剛性的問題考慮在內(nèi)。五字策略仍需用代謝剛性理論來校驗、補充和修正。根據(jù)五字策略制訂育種方案，必要時需要對載流路徑上的主要節(jié)點（產(chǎn)物形成時代謝流量發(fā)生明顯改變的節(jié)點）的性質(zhì)進行評估。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 157 五字策略與代謝工程是互補的，各有側(cè)重的。常規(guī)育種成本低，實驗周期短，采用五字策略一般都能取得比較好的效果（五個字中只要有兩三個字有效）。代謝工程育種有時也要以常規(guī)育種的成果菌種作為基礎(chǔ)材料。因此，五字策略宏觀指導(dǎo)下的代謝工程育種也許更切合工業(yè)生產(chǎn)實際。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 158 細胞經(jīng)濟假說與細 胞經(jīng)濟學(xué)的萌芽 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 159 微生物細胞的代謝實際上是自然界的一種經(jīng)濟運行。細胞經(jīng)濟假說 把微生物細胞作為按特殊的經(jīng)濟規(guī)律運行的經(jīng)濟實體來看待。我們把這種按特殊的經(jīng)濟規(guī)律運行的 有利于微生物的生存競爭的新陳代謝整體性 叫做 細胞經(jīng)濟性 。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 160 微生物群體作為大自然的不可分割的部分，如大自然一樣，有其自身的運行規(guī)律。人類社會同樣是大自然的不可分割的部分，也有其自身的經(jīng)濟運行規(guī)律。然而， 因為人有智慧，有認識大自然（包括人類自身）的經(jīng)濟運行規(guī)律的能力，所以有可能局部地改變大自然 經(jīng)濟運行的狀況 ，但無法改變大自然（包括微生物） 經(jīng)濟運行的規(guī)律 。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 161 我們研究微生物經(jīng)濟運行的狀況，就是為了要逐步認識微生物經(jīng)濟運行的規(guī)律，以便應(yīng)用這些規(guī)律為人類造福為世界消災(zāi)。 細胞經(jīng)濟假說用經(jīng)濟的眼光來分析和認識微生物細胞的生存保障問題，走出了細胞經(jīng)濟學(xué)研究的第一步。在細胞經(jīng)濟假說的研究中我們嘗試對細胞的經(jīng)濟運行與社會的經(jīng)濟運行進行比較研究，這樣的比較研究從微生物細胞經(jīng)濟開始，是因為： 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 162 ①微生物細胞中經(jīng)濟規(guī)律是 客觀存在 的；②一個 微生物細胞本身就是一個微觀經(jīng)濟體系 ，經(jīng)濟結(jié)構(gòu)相對簡單，調(diào)節(jié)機制多樣化； ③ 控制 微生物細胞的代謝活動 相對容易 ；④在研究微生物細胞經(jīng)濟運行規(guī)律的基礎(chǔ)上 構(gòu)建發(fā)酵工程生物學(xué)理論 ； ⑤自然科學(xué)與人文科學(xué)交叉，形成 新的學(xué)科生長點 。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 163 發(fā)酵學(xué)與微觀經(jīng)濟學(xué)的交叉 微生物細胞經(jīng)濟的運行狀況 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 164 發(fā)酵學(xué)與微觀經(jīng)濟學(xué)的交叉 學(xué)科 是指一定科學(xué)領(lǐng)域或一門科學(xué)的分支。 學(xué)說是指學(xué)術(shù)上自成系統(tǒng)的主張和理論。 在化學(xué)、生物化學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)、細胞學(xué)、微生物代謝生理學(xué)，以及儀器分析、傳感技術(shù)、計算機技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)上， 發(fā)酵正在從技藝（ technique）走