【正文】 在化學、生物化學、微生物學、分子生物學、細胞學、微生物代謝生理學，以及儀器分析、傳感技術、計算機技術發(fā)展的基礎上， 發(fā)酵正在從技藝（ technique）走向科學。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 163 發(fā)酵學與微觀經(jīng)濟學的交叉 微生物細胞經(jīng)濟的運行狀況 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 164 發(fā)酵學與微觀經(jīng)濟學的交叉 學科 是指一定科學領域或一門科學的分支。 細胞經(jīng)濟假說用經(jīng)濟的眼光來分析和認識微生物細胞的生存保障問題，走出了細胞經(jīng)濟學研究的第一步。然而， 因為人有智慧，有認識大自然（包括人類自身）的經(jīng)濟運行規(guī)律的能力，所以有可能局部地改變大自然 經(jīng)濟運行的狀況 ，但無法改變大自然（包括微生物） 經(jīng)濟運行的規(guī)律 。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 160 微生物群體作為大自然的不可分割的部分，如大自然一樣，有其自身的運行規(guī)律。細胞經(jīng)濟假說 把微生物細胞作為按特殊的經(jīng)濟規(guī)律運行的經(jīng)濟實體來看待。因此，五字策略宏觀指導下的代謝工程育種也許更切合工業(yè)生產(chǎn)實際。常規(guī)育種成本低，實驗周期短，采用五字策略一般都能取得比較好的效果（五個字中只要有兩三個字有效）。根據(jù)五字策略制訂育種方案，必要時需要對載流路徑上的主要節(jié)點（產(chǎn)物形成時代謝流量發(fā)生明顯改變的節(jié)點）的性質(zhì)進行評估。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 156 代謝途徑分析以及基于這些分析所進行的分子遺傳學操作，必須把代謝網(wǎng)絡節(jié)點剛性的問題考慮在內(nèi)。如果目標節(jié)點為撓性節(jié)點或弱剛性節(jié)點 ， 則可放心按 應用五字策略制訂育種 方案進行相應的遺傳操作，因為撓性節(jié)點對代謝流的導向是最順從的。按五字策略制定育種方案時，盡管是以從原料到產(chǎn)物的載流路徑及其調(diào)節(jié)機制為依據(jù)的，但一般并沒有把節(jié)點剛性的因素考慮在內(nèi)；在實施時也就不可能完全達到預期目標。如此按部就班反復進行實踐，從代謝的整體上改善細胞的性能和應用前景。為發(fā)酵工程研究人員和技術人員學習和應用代謝工程的代謝分析和綜合技術打好了理論基礎。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 151 代謝工程與五字策略 的互補性 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 152 微生物生物工程基本理論已對代謝流及其控制作了定性或半定量的分析，并在此基礎上建立了代謝導向的五字策略。網(wǎng)絡的剛性程度取決于主要節(jié)點的性質(zhì)及其在網(wǎng)絡中的分布。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 149 獨立型亞網(wǎng)絡： 亞網(wǎng)絡的主要節(jié)點不是以按比例縮合的方式形成產(chǎn)物，改變?nèi)魏我粋€節(jié)點上的流量分配就有可能提高產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率，但節(jié)點的重要性不同。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 147 S B P 1 2 S B1 B2 P 依賴型亞網(wǎng)絡 獨立型亞網(wǎng)絡 S基質(zhì) P目的產(chǎn)物 B副產(chǎn)物 節(jié)點 1 2 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 148 依賴型亞網(wǎng)絡： 亞網(wǎng)絡中的每個節(jié)點向終端產(chǎn)物貢獻一個 按化學計量 消耗的組成部分；所有分支的流量必須達到化學計量平衡，以防胞內(nèi)代謝中間物的累積和分泌。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 146 代謝網(wǎng)絡與亞網(wǎng)絡 代謝網(wǎng)絡的包含 2 個以上節(jié)點的任何部分，都可以稱為該代謝網(wǎng)絡的亞網(wǎng)絡。這種控制很有趣的特性是，最受影響的酶 IL 沒有受到直接控制。 因為與IDH 相比， IL 對異檸檬酸有一個顯著高的 Km ， 所以異檸檬酸濃度的下降使通過該支路的流量有一個很大程度（約 99%）的減少。因為這兩種酶的動力學的相互控制，通過該支路的流量對異檸檬酸濃度水平的變化極端敏感。在異檸檬酸生理濃度時（ 約 160μmol 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 143 上圖概括了在 乙酸鹽上生長時，兩種互相競爭酶的動力學 參數(shù)。當給予細胞更有利的碳源時，如葡萄糖， IDH就會迅速脫磷酸而被激活。當細胞在醋酸鹽基質(zhì)上生長時，異檸檬酸裂合酶（ IL） 被誘導； 醋酸鹽在碳架物質(zhì)的回補方面起重要作用，否則碳架物質(zhì)就會在 TCA循環(huán)中以 CO2的形式丟失。剛性節(jié)點不僅能限制產(chǎn)物得率，而且通過 簡單的 酶活性弱化不容易減輕這種作用。也有可能因為弱化無用的途徑而引起中間代謝物的分泌，而不是流量的降低或代謝流的方向的改變。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 139 因為復雜、多樣的控制結(jié)構(gòu)和酶動力學，代謝網(wǎng)絡并不總是呈現(xiàn)上述分類所暗示的對于流量分配的二元響應 。然而，對于強剛性節(jié)點，這種做法將導致 P2的低水平，所以 P1 分支途徑將會喪失 P2對它的激活作用。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 138 假定目標是增加 P1分支的分流比，而且，在沒有激活劑 P2存在時， P1的穩(wěn)態(tài)濃度（ steady state concentration） 高得足以抑制它本身的合成。 剛性節(jié)點對途徑的產(chǎn)物得率施加控制性的影響，它的解除調(diào)節(jié)比酶學的弱化可能更為復雜。在這個例子中，每個產(chǎn)物代謝物作為其競爭分支途徑的激活劑，同時又作為其自己合成途徑的抑制劑。另一方面，如果優(yōu)勢分支途徑的活性被減弱，就會顯著增加流入從屬分支途徑的流量。 這是由于優(yōu)勢分支途徑的酶對共同代謝物（節(jié)點）有更大的親和力，并且（或者）優(yōu)勢分支途徑的酶比從屬的分支途徑的酶有更大的整體活性。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 135 弱剛性節(jié)點的分流比由一個分支途徑（優(yōu)勢分支）控制 ，這可能是由于優(yōu)勢分支途徑的第一個酶具有較高的比活力和（或）較高的底物（節(jié)點）親和力，并且不受反饋抑制；即使從屬分支（假定是流向產(chǎn)物的分支）解除調(diào)節(jié)，還是有相當大的一部分流量依然進入優(yōu)勢分支，從而限制產(chǎn)物得率的上升。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 134 ③弱剛性節(jié)點（ weakly rigid node）：性能上處于前述兩種節(jié)點之間的節(jié)點原則上都屬于弱剛性節(jié)點。 從這些節(jié)點出發(fā)的互相競爭的分支途徑的第一個酶，對節(jié)點（酶的底物）有類似的底物親和力，有類似的酶反應速率。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 133 ② 撓性節(jié)點（ flexible node）： 屈服于分流比改變的節(jié)點。所謂聯(lián)合作用，是指各個分支途徑自身的反饋控制和與之競爭原料的分支途徑的產(chǎn)物對它的交叉激活，兩種機制一起發(fā)生作用。 如果某節(jié)點處的分流比受到該處的一條或多條支路嚴格的控制，這樣的節(jié)點被稱為剛性節(jié)點。分支處為節(jié)點。節(jié)點的剛性取決于微生物代謝的自動調(diào)節(jié)機制。 剛 ，取其 抵抗改變之意； 撓 ，取其 屈服順從 之意。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 129 雖然由不同生物體調(diào)節(jié)代謝流量所用的代謝控制機制明顯地多樣化，然而基于在節(jié)點處代謝流的分流比的控制特性，對節(jié)點進行分類。 在生物學過程中，往往由于途徑的酶水平或酶活性而影響途徑的產(chǎn)品的得率。 代謝網(wǎng)絡的剛性與主要節(jié)點的剛性大小、分布及數(shù)量密切相關。 本小節(jié)將從 節(jié)點的剛性 、 網(wǎng)絡的剛性 、 剛性代謝（生命保障體系 ）的基本概念出發(fā)，進而追究剛性的由來，以及 生存保障體系 與 代謝變動性 、 遺傳保守性 的關系，簡單地討論代謝網(wǎng)絡剛性理論。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 123 人對微生物的生命活動規(guī)律理解得愈深，對微生物代謝的引導就愈有效，在發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中的主動權(quán)就愈大。正確理論的指導和應順自然規(guī)律的實踐能夠使對立向統(tǒng)一轉(zhuǎn)化。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 121 發(fā)酵工程的基本矛盾在于：人出于經(jīng)濟利益對微生物代謝的導向與微生物的細胞的生存保障體系對這種導向的抵抗。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 120 在微生物生命活動中，微生物細胞生存的保障體系有利于它們自身的生存競爭；在發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中，人類要利用微生物的生命活動謀求經(jīng)濟效益。 在發(fā)酵工業(yè)中人客觀上處于被動的地位，而微生物在求生存的方向上始終是主動的。 發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)依賴于微生物生命活動；微生物活細胞在人給定的條件下進行新陳代謝，完成人交給它們的生產(chǎn)任務。 如果工業(yè)發(fā)酵的目的僅僅是為了獲得菌體細胞，事情還好辦些，因為這與微生物進化的目標一致；但如果要想獲得的化學物質(zhì)是代謝的中間產(chǎn)物，或細胞的生物大分子或其它細胞物質(zhì)的話，那就要求微生物過量地合成這些物質(zhì)，而且還要及時將它們排出細胞。 微生物代謝過程中任何中間產(chǎn)物、細胞組分或酶的過多產(chǎn)生都是與其求生存的利益背道而馳的，只有當 3 個子系統(tǒng)協(xié)調(diào)運轉(zhuǎn)，實現(xiàn)最大限度的生長和繁殖，才是符合微生物自身利益的。科學和技術工作的目的就在于努力促使對立向統(tǒng)一的轉(zhuǎn)化。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 115 微生物生命活動有其自己的生存、發(fā)展的保障機制，這些機制服務于它們自身的生存競爭；在工業(yè)生產(chǎn)中，人類通過微生物的生命活動謀求經(jīng)濟效益。 人類要利用微生物為自己服務，就必須研究、了解并遵循微生物的生命活動規(guī)律， 在可能范圍內(nèi)對微生物的生命活動進行 引導 ，而不是隨意將自己的意志強加給微生物。微生物有它自己的相對穩(wěn)定的生命活動規(guī)律，這些規(guī)律是經(jīng)千千萬萬年的物競天擇而穩(wěn)定下來的。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 113 微生物的生存利益與人類的經(jīng) 濟利益的對立與統(tǒng)一 人類和微生物同樣都是地球的居民，都是生命體，在地球生存空間處于理論上的平等的地位。因此，為了在工業(yè)發(fā)酵中爭取主動，必須發(fā)揮人的主觀能動作用，協(xié)調(diào)好工業(yè)生產(chǎn)中人類的經(jīng)濟利益與微生物生存競爭之間的關系。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 112 微生物具有造福于人類的巨大潛力，人類利用微生物可以實現(xiàn)更多美好的理想。 天然存在的各種微生物物種的生命活動過程 —— 不論是造福于人類或危害人類的 —— 都是它們按它們自己的生命活動規(guī)律進行生存競爭的新陳代謝過程。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 111 因此，它們是經(jīng)物競天擇而得到的階段性進化成果。天然存在的微生物物種是微生物在大自然中進行生命活動和發(fā)生遺傳物質(zhì)的變化。既然微生物的細胞經(jīng)濟的價值取向是自我保障，那么工業(yè)發(fā)酵與細胞經(jīng)濟之間有什么關系呢？ 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 109 微生物的天然進化不可能刻 去照顧人類的利益 微生物的生存利益與人類的 經(jīng)濟利益的對立與統(tǒng)一 發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中的人的主觀 能動作用的發(fā)揮 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 110 人類的利益 生命是 以遺傳信息維系的、以不斷自我更新的形式存在于時間和空間的 過程 ，因此必須以 歷史唯物主義的觀點 來研究微生物進化和發(fā)展。生物工程和發(fā)酵工程科技人員認識微生物細胞就是要它們工作，因此就更關注它們工作的 能力 和 局限性 ，也就是微生物細胞的 經(jīng)濟工作原理。因此很有必要在此領域從事更多的研究，并要吸取在初級代謝生理學的類似研究中所得到的經(jīng)驗和教訓。產(chǎn)品形成的生理學的基本道理是容易理解的。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 103 不能忽視這個事實： 放線菌與細菌相比較，是次級代謝產(chǎn)物的更好的生產(chǎn)者，放線菌有細胞分化的能力，而次級代謝往往與分化過程有關。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 102 次級代謝產(chǎn)物一般是在分批培養(yǎng)的 分化期 開始形成，即在限制生長或沒有生長的條件下形成的。 雖然次級代謝產(chǎn)物多種多樣，但從生物化學的角度來看，大多數(shù)次級代謝產(chǎn)物都是從少數(shù)關鍵的中間代謝產(chǎn)物“ 組裝 ” 的： 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 100 莽草酸、有關幾種氨基酸、 AcCoA 等 次級代謝的前體庫 次級代謝產(chǎn)物 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 101 因此，用來匯入次級代謝前體庫的代謝流對次級代謝是至關重要的。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 99 抗生素是次級代謝產(chǎn)物中按功能而劃定的復雜化合物類群。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 98 次級代謝一旦建立，就將服從寄主細胞固有的調(diào)節(jié)機制，并且有可能引伸出特殊的調(diào)節(jié)機制。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 97 換句話說，為次級代謝途徑編碼的 DNA如果對細胞的任何一種組織水平 ， 包括中間代謝、調(diào)節(jié)、輸送、分化、形態(tài)發(fā)生等等