【正文】 生產(chǎn)細(xì)胞），不支持（人的） 目的產(chǎn)物的過(guò)量生產(chǎn)（生產(chǎn)特定的初級(jí)代謝產(chǎn)物）。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 31 把自然界中自然競(jìng)爭(zhēng)中幸存的微生物稱為 野生型微生物 ，它們具有比較嚴(yán)密的代謝調(diào)節(jié)功能，至少在它們幸存的環(huán)境條件下不會(huì)過(guò)量合成初級(jí)代謝產(chǎn)物。要做到這一點(diǎn)，不僅要求合成目的產(chǎn)物的途徑暢通，還必須有將目的產(chǎn)物排出細(xì)胞的滿意的機(jī)制。體現(xiàn)了微生物細(xì)胞的 經(jīng)濟(jì)性 。這種兩個(gè)“閥門(mén) ”交替控制的機(jī)制可以解釋為什么在 嚴(yán)格厭氧條件下，大腸桿菌經(jīng) HMP 途徑降解的葡萄糖只占葡萄糖降解總量的 20％～ 30％。 NADH是 6磷酸葡萄糖脫氫酶（ G6PDH ） 的效應(yīng)物， NADH 濃度上升 就會(huì)抑制 G6PDH， 使 G6PDH 成為 HMP降解流上的另一個(gè) “ 閥門(mén) ” （ 厭氧條件下的控制 “ 閥門(mén) ” ）。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 27 在厭氧條件下 ， PFK和 FDPA水平較有氧時(shí)高，因而 EMP 途徑對(duì)葡萄糖降解代謝的參與程度增加 。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 26 在有氧條件下 ，由于 PFK的低水平和 FDP 醛縮酶（ FDPA） 的極端低水平， 大腸桿菌主要經(jīng) HMP 途徑降解葡萄糖 。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 24 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 25 上圖（碳架物質(zhì)在 EMP和 HMP途徑上的分流控制圖）是一張按此方法標(biāo)示的網(wǎng)絡(luò)圖， 請(qǐng)按此方法讀圖，并從以下說(shuō)明中得到幫助。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 23 例如：某效應(yīng)物名稱后面加上 “ I”， 標(biāo)在代表酶的箭頭旁邊，表示該效應(yīng)物對(duì)該酶的 抑制作用 ；效應(yīng)物名稱后面加上 “ A”，標(biāo)在代表酶的箭頭旁邊，表示該效應(yīng)物對(duì)該酶的 激活作用 ；效應(yīng)物名稱后面加上 “ R”，標(biāo)在代表酶的箭頭旁邊，表示該效應(yīng)物對(duì)該酶的 阻遏作用 。 因此我們要 啟用一種新的代謝調(diào)節(jié)圖圖例，用來(lái)標(biāo)記代謝網(wǎng)絡(luò)圖 。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 20 在生物化學(xué)中，早有一套描述代謝途徑的調(diào)節(jié)機(jī)制的方法，例如，用一個(gè)從效應(yīng)物（途徑的終端產(chǎn)物）引出的、指向途徑中某個(gè)代表酶的短箭頭的長(zhǎng)箭頭來(lái)標(biāo)示反饋調(diào)節(jié)。這個(gè)分配既與遺傳因素有關(guān)，又與條件因素有關(guān)。初級(jí)代謝網(wǎng)絡(luò)的中心板塊上的 12 種前體代謝物 是當(dāng)然的 節(jié)點(diǎn) ，而且還是代謝途徑的 分流 或匯流 處。 治理的直接的目的是讓微生物細(xì)胞過(guò)量合成（ overproduction ） 人們所需要的代謝產(chǎn)物。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 16 微生物的 代謝途經(jīng)的變動(dòng)性和可調(diào)節(jié)性 ，不但是代謝流飄移的內(nèi)在原因，而且也是人工控制代謝流的生物學(xué)根據(jù)。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 15 在這個(gè)認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上，結(jié)合代謝能支撐假說(shuō)和代謝網(wǎng)絡(luò)假說(shuō)的內(nèi)容，討論微生物的代謝及代謝流的變動(dòng)性；結(jié)合本章（ 代謝調(diào)節(jié)的 3 個(gè)子系統(tǒng) ）的內(nèi)容，討論代謝流對(duì)環(huán)境條件的響應(yīng)和代謝流治理的可能性。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 14 如果把碳架物質(zhì)流看作水一樣的流體，那么按照工業(yè)發(fā)酵的工作模式，就可把微生物活細(xì)胞看作是有一個(gè)總的進(jìn)水口和一個(gè)總的出水口的、包含特定的管道網(wǎng)的大容器，組成管道網(wǎng)的管道有粗有細(xì)，管道網(wǎng)的管道有分支、有交叉，有可控的閥門(mén)。 N代表 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) ， P代表 目的產(chǎn)物 。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 10 Working pattern of cellmachine in Industrial Fermentation 工業(yè)發(fā)酵細(xì)胞機(jī)器的工作模式 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 11 上圖中，白色橢圓代表細(xì)胞的 界面 ，界面包圍部分是 細(xì)胞機(jī)器 ，界面外側(cè)是細(xì)胞機(jī)器所在的 環(huán)境 。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 7 有機(jī)化合物的組成元素及它們 各自在生命活動(dòng)中的作用（略） 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 8 碳架物質(zhì)在代謝途徑中的流動(dòng) 以代謝流動(dòng)的觀點(diǎn)加深對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)：碳架物質(zhì)在網(wǎng)絡(luò)的有關(guān)途徑中流動(dòng)，從原料到終端產(chǎn)物碳架物質(zhì)流經(jīng)的路徑叫做 載流路徑 。因此，在討論化能異養(yǎng)型微生物代謝流動(dòng)時(shí)，首先抓住碳元素代謝這個(gè)主要矛盾，研究微生物細(xì)胞的碳架物質(zhì)流。此外，還有流速和流量等問(wèn)題。2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 1 第三節(jié) 代謝網(wǎng)絡(luò)中碳架 物質(zhì)流的調(diào)動(dòng) 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 2 處于一定環(huán)境條件下的微生物培養(yǎng)物中，參與代謝的物質(zhì)在代謝途徑（網(wǎng)絡(luò)）中按一定規(guī)律流動(dòng)，形成微生物代謝的物質(zhì)流。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 3 代謝物質(zhì)的流動(dòng)過(guò)程是一種類似“流體流動(dòng)” 的過(guò)程，它具備流動(dòng)的一切屬性，諸如 方向性、連續(xù)性、有序性、可調(diào)性等等， 并且可以接受疏導(dǎo)、阻塞、分流、匯流等 “ 治理 ”， 也可能發(fā)生“ 干枯 ”和“溢出 ( 泛濫 ) ”等現(xiàn)象。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 4 化能異養(yǎng)型微生物以有機(jī)化合物為碳源和能源。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 5 碳架物質(zhì)在代謝途徑（代 謝網(wǎng)絡(luò)）中的流動(dòng) 微生物的代謝流及其治理 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 6 碳架物質(zhì)在代謝途徑（代謝網(wǎng)絡(luò)）中的流動(dòng) 在典型的工業(yè)發(fā)酵過(guò)程中，微生物的代謝流包括營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞、代謝中間物（碳架物質(zhì)）在代謝途徑中的流動(dòng)和代謝產(chǎn)物從細(xì)胞進(jìn)入環(huán)境這樣順序發(fā)生的過(guò)程。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 9 典型工業(yè)發(fā)酵的工作模式 典型的工業(yè)發(fā)酵要從發(fā)酵液中獲得微生物的代謝產(chǎn)物，也就是要讓原料有機(jī)化合物在微生物細(xì)胞的有關(guān)的代謝途徑（載流路徑）中流動(dòng)的過(guò)程中，轉(zhuǎn)化成工業(yè)發(fā)酵的目的產(chǎn)物，最后目的產(chǎn)物分泌出細(xì)胞。帶箭頭的黑線代表典型的工業(yè)發(fā)酵的細(xì)胞機(jī)器的 載流路徑 。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 12 微生物的代謝流及其治理 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 13 我們?cè)鴱?熱力學(xué) 的角度把微生物看作遠(yuǎn)離平衡狀態(tài)的不平衡的開(kāi)放體系；我們?cè)柚?電學(xué) 的知識(shí)來(lái)討論生物氧化和代謝能的問(wèn)題；我們?cè)栌没ヂ?lián)網(wǎng) 的概念來(lái)討論代謝網(wǎng)絡(luò)的延伸問(wèn)題；在這里我們要借用 流體力學(xué) 的常識(shí)來(lái)分析微生物細(xì)胞的代謝流。 代謝物質(zhì)流就如同自來(lái)水一樣在管道和閥門(mén)的控制下流進(jìn)和流出細(xì)胞，形成代謝流。最后還要討論有關(guān)代謝節(jié)點(diǎn)的剛性的問(wèn)題。 工業(yè)發(fā)酵中，人的主觀能動(dòng)作用表現(xiàn)在對(duì)代謝流的治理上。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 17 碳架物質(zhì)在代謝網(wǎng)絡(luò)中流經(jīng)的 分支處及各分支的流量分配 過(guò)量合成與微生物的異常代謝 溢出代謝 代謝流治理的可能性和現(xiàn)實(shí)性 代謝網(wǎng)絡(luò)的剛性 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 18 碳架物質(zhì)在代謝網(wǎng)絡(luò)中流經(jīng)的分支處及各分支的流量分配 我們把代謝網(wǎng)絡(luò)中代謝途徑的交叉點(diǎn)叫做代謝網(wǎng)絡(luò)的 “ 節(jié)點(diǎn) ”， 實(shí)際上它們是碳架物質(zhì)在代謝網(wǎng)絡(luò)中流經(jīng)的 代謝中間物 。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 19 節(jié)點(diǎn)處不論發(fā)生匯流還是分流，都存在 流量分配 的問(wèn)題。 不同微生物物種的代謝途徑基本一致， 因此，可在微生物學(xué)有關(guān)工具書(shū)查到有關(guān)的途徑； 而代謝調(diào)節(jié)機(jī)制并不完全一樣 ，不一致的情況可在有關(guān)論文或綜述中找到。這種標(biāo)示方法對(duì)于線狀途徑或偶有分支的途徑來(lái)說(shuō)，是很有用的，但是，如果在代謝網(wǎng)絡(luò)圖中使用，代表調(diào)節(jié)的箭頭與代表酶的箭頭交織在一起，容易引起誤解。這種標(biāo)記方法有四個(gè)要點(diǎn)： 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 21 ① 標(biāo)明調(diào)節(jié)方式 用“ I”表示 抑制 （ inhibition）， 用“ A”表示 激活 （ activation ）， 用 “ R” 表示 阻遏 （ repression）； ② 標(biāo)明效應(yīng)物 一般用三個(gè)字母標(biāo)示效應(yīng)物（ 調(diào)節(jié)特定的酶的水平或活性的化合物 叫做這種酶的效應(yīng)物） ； 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 22 ③ 標(biāo)明受調(diào)節(jié)的酶： 代謝網(wǎng)絡(luò)圖中箭頭所代表的酶的名稱放在括號(hào)內(nèi)， 標(biāo)在該箭頭旁邊； ④對(duì)酶的調(diào)節(jié)的 具體的表示方法 ： 在代表酶的箭頭旁邊標(biāo)上代表效應(yīng)物的 3 個(gè)字母和代表調(diào)節(jié)機(jī)制的特定字母。如果 2 種效應(yīng)物 協(xié)同作用 ，則在兩個(gè)效應(yīng)物的名稱都寫(xiě)上，再在后面加上對(duì)應(yīng)的英文字母。 大腸桿菌細(xì)胞磷酸果糖激酶（ PFK）的酶水平隨條件而變動(dòng)，有氧生長(zhǎng)中細(xì)胞的 PFK水平低于厭氧生長(zhǎng)中的細(xì)胞，有氧生長(zhǎng)中的細(xì)胞的 PFK（ 由二聚體組成），對(duì) ATP不敏感，厭氧生長(zhǎng)中的細(xì)胞的 PFK （ 由四聚體組成），對(duì) ATP敏感。 因?yàn)樵谟醒鯒l件下 PFK 對(duì) ATP不敏感，且其活力高于 FDP醛縮酶（ FDPA ）， FDP 有累積 ，所以它可能對(duì) HMP 途徑的 6磷酸葡萄糖酸脫氫酶（ 6PGDH ） 起抑制物的作用，使 6PGDH成為 HMP降解流上的一個(gè)“閥門(mén)”（有氧條件下的控制“閥門(mén)”）。 因?yàn)? PFK 的水平仍高于FDPA， FDP 仍然累積并繼續(xù)抑制 6PGDH，但隨著 EMP參與程度的增加， EMP 途徑所產(chǎn)生的 NADH濃度增高 。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 28 這種抑制作用是必要的，因?yàn)樘岣咂咸烟菨舛瓤梢允? FDPA水平上升許多倍，而 PFK 水平基本保持不變，這樣 FDP 濃度勢(shì)必是低的，以致無(wú)法控制 6PGDH ，這時(shí) NADH就通過(guò)對(duì) G6PDH 的抑制作用控制 HMP 降解流。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 29 過(guò)量合成和微生物的異常代謝 野生菌株在它們天然棲息地在其生長(zhǎng)或維持，需要時(shí)也能合成人們所希望的代謝產(chǎn)物，但在其固有的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制的控制下合成的量不多不少，只夠細(xì)胞自身生長(zhǎng)或維持的需要。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 30 適用于發(fā)酵生產(chǎn)的微生物必須具有有過(guò)量合成的能力，也就是說(shuō)是其目的產(chǎn)物的合成量必須大大高于它通常的合成量。 過(guò)量合成的速率取決于微生物的遺傳性能，以及在培養(yǎng)條件下細(xì)胞的生理狀態(tài)。 在這樣的細(xì)胞經(jīng)濟(jì)體系中，細(xì)胞的生產(chǎn)力體現(xiàn)在其自身的增殖。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 32 要解放細(xì)胞對(duì)于目的產(chǎn)物（特定的初級(jí)代謝產(chǎn)物）的生產(chǎn)力，就有必要改變細(xì)胞原有的生產(chǎn)關(guān)系。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 33 微生物過(guò)量合成目的產(chǎn)物（ 特定的代謝中間產(chǎn)物 ）的過(guò)程，實(shí)質(zhì)上是 功能殘缺 或 遺傳失常 的微生物細(xì)胞在人為的特定條件下進(jìn)行 異常代謝 的過(guò)程。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 34 微生物排出某些 能量代謝副產(chǎn)物的過(guò)程，實(shí)質(zhì)上是兼性厭氧微生物在環(huán)境條件逼迫下（如缺氧），變通地維持生計(jì) 的過(guò)程。 例如釀酒酵母在發(fā)酵液中累積能量代謝副產(chǎn)物乙醇的過(guò)程，就是這樣的過(guò)程。采用改變環(huán)境條件或限制營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)等方法，可促使微生物進(jìn)行溢出代謝。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 36 ⑴ 檸檬酸的溢出代謝： 多種微生物均能因受激而過(guò)量合成檸檬酸。 黑曲霉之所以能在特定環(huán)境條件下累積檸檬酸，是因?yàn)樵谶@種環(huán)境條件下代謝途徑前段的運(yùn)轉(zhuǎn)速率大于后段的運(yùn)轉(zhuǎn)速率。引起溢出代謝的原因包括以下三個(gè)方面： 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 37 Glc G6P (PFK) CTA ,NH4 I ?+ A FDP PYR OAA AcCoA CTA CAA ICA α KG (PC) (CS) (KD) 黑曲霉中檸檬酸的代謝溢出 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 38 ① 高水平的檸檬酸合成能力 。第一是在有高濃度草酰乙酸（ OAA ） 的情況下對(duì) AcCoA 具有高度親和力的組成型的 檸檬酸合成酶 （ CS ） 的存在；第二是催化丙酮酸 （ PYR ） 固定 CO2 生成草酰乙酸反應(yīng)的高水平的組成型的 丙酮酸羧化酶 （ PC ） 的存在；第三是在缺少錳的條件下，蛋白質(zhì)分解或蛋白質(zhì)合成受阻造成的 銨的高濃度能解除