【正文】 檸檬酸（ CTA） 對磷酸果糖激酶（ PFK） 的抑制。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 39 ② 較低的降解檸檬酸的能力。第一是 低水平的 α酮戊二酸脫氫酶 （ KD ） 影響 TCA環(huán)運行的暢通程度， 使 TCA環(huán)前半部的中間產物積壓； 第二，在錳缺乏的條件下， 順烏頭酸酶（ AE ） 和 異檸檬酸脫氫酶 （ ID） 的活性降低 ，從而使檸檬酸的累積比其它幾種酸（ 順烏頭酸、異檸檬酸和 α酮戊二酸）更明顯。錳與鐵的缺乏有利于檸檬酸的排出。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 42 這樣的二段生長現(xiàn)象曾被認為是呼吸途徑的阻遏和解阻遏，而且認為是分解代謝物阻遏（此名稱已被營養(yǎng)阻遏代替，見本章 ）。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 43 細胞并不會因為葡萄糖的高速消耗而附帶地形成足夠高的呼吸能力（指呼吸鏈使 NADH再生的能力）與之配套；而且葡萄糖的異生成途徑（需 NADH） 因受到高濃度的葡萄糖的調節(jié)而受阻，更加強了瓶頸效應。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 44 在供氧情況下，釀酒酵母細胞中葡萄糖主要經 EMPTCA 途徑（ 少量經 HMP途徑 ）氧化降解。 當葡萄糖濃度較低時，葡萄糖氧化降解過程所需配套的電子傳遞能力處于電子傳遞鏈傳遞能力范圍以內，這時氧的吸收速率與細胞的生長速率成線性關系。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 45 當葡萄糖的濃度超過某值，葡萄糖氧化降解過程所需配套的電子傳遞能力超越微生物細胞電子傳遞鏈傳遞能力范圍，一部分 NADH不能通過電子傳遞鏈而再生成 NAD+， 只好將電子交給內源的有機化合物乙醛，將乙醛還原成乙醇，從而實現(xiàn)還原力的平衡。 由此可見，乙醇的溢出代謝實際上是細胞內生物氧化過程中形成的還原力相對于電子傳遞鏈的呼吸能力的溢出，推動了乙醛還原生成乙醇的發(fā)酵過程。 對于工業(yè)發(fā)酵來說，就是特定的生產菌種和與其對應的生產工藝條件。 本課程主要討論初級代謝產物的過量合成，兼顧次級代謝產物的合成。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 49 細胞機器與普通意義上的機器不同，它們 必須由代謝能 （ metabolic energy） 直接驅動 。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 50 根據(jù)工業(yè)發(fā)酵的現(xiàn)狀， 把依靠化能異養(yǎng)型微生物合成某最終被分泌到胞外的初級代謝產物的過程，作為工業(yè)發(fā)酵的典型過程來研究，并把代謝研究的重點放在碳的代謝上。在此 工作模式 的基礎上，提出了工業(yè)發(fā)酵中微生物代謝的 五段式 和初級代謝產物的過量合成的 五字策略 。微生物通過生存競爭而獲得的一整套自我調節(jié)機制，原本服務于微生物的自然競爭和生命保障，因此它不會大量的合成維持自我生存之外的代謝產物。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 52 微生物代謝產物的生物合成是系統(tǒng)工程，要完成這一類系統(tǒng)工程，必須依靠微生物的高度有序的生命活動，決不是打亂它，而是在可能的范圍內對它進行有效的引導。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 53 ⑴ 初級代謝產物的合成 初級代謝產物是指這樣一些低分子質量的合成途徑的終產物，它們 是構建生物大分子的分子模塊 ，是微生物營養(yǎng)性生長所必需的生長因子，如氨基酸、嘌呤和嘧啶的核苷與核苷酸以及維生素。 因為它們都是微生物營養(yǎng)性生長所必需的，除了遺傳上有缺陷的菌株外，微生物細胞具有齊全的初級代謝途徑基因，也就是說 在合適的環(huán)境條件下它們的初級代謝途徑是普遍存在的 。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 55 各種微生物的初級代謝產物的合成途徑基本相同，在同一屬微生物中，初級代謝產物合成途徑的差異是十分罕見的，但在合成的調節(jié)機制上有較大的差異。 這種“治理”要用到遺傳手段（ 遺傳脫鉤 ），并輔之以培養(yǎng)條件的優(yōu)化（ 環(huán)境協(xié)調 ），以求達到 初級代謝產物過量合成的目的。首先細胞外的營養(yǎng)物質從環(huán)境（培養(yǎng)基）跨膜進入細胞；然后，一般要經過向心、中心和離心 3 段連續(xù)的代謝途徑的代謝，才能在胞內生成目的產物；最后，目的產物經過膜排出細胞，回到環(huán)境（發(fā)酵醪液）。 “載流路徑” 泛指由不止一條載流途徑按序首尾銜接而組成的代謝通道。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 58 典型的 載流路徑 是指存在于代謝網絡中的這樣的代謝通道，即 由多至五段承擔不同代謝分工的、依次銜接的代謝途徑組成的代謝通道。在這條載流路徑上流動的代謝主流對應地也有五段，從而派生出 代謝主流的五段式 。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 59 在此五段式的基礎上，從不同的角度出發(fā)，提出能作為一個整體，用于設計育種以及發(fā)酵工藝控制的五字策略（簡稱 工業(yè)發(fā)酵的五字策略 ）：進、通、節(jié)、堵、出。這個策略來自初級代謝產物過量合成的研究，故實際上是 初級代謝產物過量合成的五字策略 。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 62 進 ：在育種和發(fā)酵控制方面都要促進細胞對營養(yǎng)物質的吸收。同時要選擇適當?shù)娜菀孜盏呐囵B(yǎng)基，和適宜的培養(yǎng)條件，以促進微生物的生長。為了促進微生物的生長和支持目的產物的合成，還要從代謝生理學的角度優(yōu)化流加條件。特別是當發(fā)酵進入目的產物合成階段后，必需確保載流路徑暢通，代謝主流優(yōu)勢明顯。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 65 例如在谷氨酸的發(fā)酵過程中，作為谷氨酸合成原料的 NH4+ 的缺乏， 就可能使谷氨酸合成途徑的中斷，導致谷氨酸產量下降，大量 α酮戊二酸積累。因此，在發(fā)酵過程中應盡可能的使通向載流路徑的代謝途徑暢通無阻，使不同的營養(yǎng)物質能順利地注入代謝主流，最終流向目的產物。這里所謂的 “ 節(jié)制 ” 是指封閉或削弱以目的產物合成途徑的起始底物（如下圖中的 A） 或各中間產物（如下圖中的 B、 C 和 D）為起始底物的分支途徑（ 即下圖中通向 K，G， I， J 的途徑）。細胞嚴格的調節(jié)機制不允許代謝中間產物的過量合成，要想實現(xiàn)目的產物的過量合成，就必需對其代謝進行導向（包括遺傳根據(jù)和培養(yǎng)條件的導向），迫使代謝朝著過量合成目的產物方向進行。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 69 堵 ：采用育種或發(fā)酵控制手段堵塞或削弱目的產物進一步代謝的途徑（如上圖中 F 以后的途徑），包括目的產物參與的分解代謝和合成代謝。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 70 為了消除這種影響，就必須降低目的產物進一步代謝的酶的酶活力或酶量，以消除或削弱目的產物進一步的代謝。例如，采用及時將目的產物從發(fā)酵液的分離出來的辦法，也可以間接地消除或削弱胞內目的產物的進一步代謝，甚至能拉動溢出代謝。根據(jù)微生物細胞經濟學原理（節(jié)約原理、適應原理、生命保障原理），如果細胞內某代謝中間產物濃度超過其閾值，必將受到細胞內相關代謝調節(jié)機制的干預。因此，及時將目的產物轉移到細胞外，無論從化學平衡的角度，還是從生物學信息反饋的角度，都將有利于載流路徑上代謝主流的流動。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 73 Ⅱ .有關碳架物質跨膜問題的分析 氨基酸的發(fā)酵法生產，屬于本課程定義的典型的工業(yè)發(fā)酵。此外，氨基酸的生產過程還包括細菌細胞的適度生長和生命活動的維持。 有關碳架物質跨膜問題，必要時可做專題講座。對細菌來說，天門冬氨酸族氨基酸包括 Asp、 Asn、 Lys、 The、 Ile 和 Met 共 6 種氨基酸（ 或氨基酰胺），它們都是從 TCA 環(huán)中的前體代謝物草酰乙酸（ OAA） 開始合成的。其上游部分屬于中心途徑，下游部分屬于離心途徑。關于天冬氨酸族氨基酸的合成代謝路線（下游部分）及其調節(jié)方式已匯總在下面幾張圖中： 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 77 OAA Asp βAspP Asp βSA HomoSer Thr DDP Lys Met Ile (AK1)Thr I Thr R I l e R (AK2)Met R (AK3)Lys I Lys R Lys R (HD1)I l e R Thr R (HD2) Met R PYR PYR Lys I Lys R Met I, Met R Met R Thr I I l e R 天門冬氨酸族氨基酸合成代謝的調節(jié)機制 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 78 OAA Asp βAspP Asp βSA HomoSer Thr DDP Lys Met Ile (AK) (HD) Met R Thr I PYR PYR Met R Thr I I l e R Brevibacterium flavium 天門冬氨酸族氨基酸合成代謝的調節(jié)機制 (Thr+Lys) I 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 79 OAA Asp βAspP Asp βSA HomoSer Thr DDP Lys Met Ile (AK) (HD) Met R Thr I PYR PYR Met R I l e I Brevibacterium lactofermentum 天門冬氨酸族氨基酸合成代謝的調節(jié)機制 Thr I, Lys,(Thr+Lys) I Leu R 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 80 芳香族氨基酸的合成也有類似的情況。其上游部分屬于中心途徑，下游部分屬于離心途徑。關于芳香族氨基酸的合成代謝路線（下游部分）及其調節(jié)方式已匯總在下面幾張圖中： 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 81 PEP E4P (DS3) (DS2) (DS1) Phe I Tyr I DHAP SMA CMA (CM2) (CM1) Phe I Tyr I PPA PEP Pi Phe Tyr Glu α KG Trp Glu α KG 3PGA Ser PRPP Trp I 芳香族氨基酸的合成代謝調節(jié)機制 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 82 PEP E4P (DS) Tyr,(Phe+Tyr) I DHAP SMA CMA (CM) Phe IR Tyr I PPA PEP Pi Phe Tyr Glu α KG Trp Glu α KG 3PGA Ser PRPP Trp IR Corynebacterium glutamicum 芳香族氨基酸的合成代謝調節(jié)機制 Trp A Tyr A Trp I Phe I Tyr I 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 83 下面是乳糖發(fā)酵短桿菌的賴氨酸高產菌株的 設計育種示意圖 。所謂 “ 理想載流路徑 ” 是指為了獲得高效益， 人們期望代謝流流經的路徑。上圖顯示的是乳糖發(fā)酵短桿菌的合成賴氨酸的二氨基庚二酸途徑，下圖顯示的是產黃青霉合成賴氨酸的氨基己二酸途徑。假設高絲氨酸營養(yǎng)缺陷是因為 高絲氨酸脫氫酶（ HD ） 缺損而造成的，從前面對應的圖可找出造成 LLys高產的原因：①阻止碳架物質 AspβSA 流向 HSer；② 解除 Thr、 Lys對天門冬氨酸激酶（ AK ） 的協(xié)同反饋抑制（因為細胞不能合成 Thr）；③ 省下原用于 11e合成的 PYR，以支持 Lys合成。與微生物生長有密切關系的酶的底物的結構類似物，如果能競爭性地抑制這個酶的活性，就會直接影響微生物的生長，也就是這種微生物 對這種結構類似表現(xiàn)出敏感性。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 89 根據(jù)這個道理，有可能從這種酶的底物的結構類似物的超敏性突變株中，找到這種酶的低水平突變株。 氟代丙酮酸（ FP ） 是丙酮酸（ PYR ）的結構類似物。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 90 已用超敏性突變株的方法選育了 乳糖發(fā)酵短桿菌 的 氟代丙酮酸超敏性突變株（ FPs） 。 從而實施了對 PD通道的 “ 節(jié) ”。 在 黃色短桿菌的亮氨酸缺陷型突變株 Leu上再加上結構類似物抗性標記（ AEC+Thr ） r 后 Lys產量大幅度上升，這是因為這個突變株已解除了 Lys和 Thr對天門冬氨酸激酶（ AK ） 的協(xié)同反饋抑制，是個調節(jié)突變株。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 92 ⑵