【正文】 乙醛酸循環(huán)基本上是封閉的，代謝流向異檸檬酸 → α酮戊二酸 → 谷氨酸的方向高效率地移動(dòng) 兩者綜合的作用使得，異檸檬酸裂解酶的活性喪失， DCA循環(huán)得到封閉。 結(jié)論 氨的導(dǎo)入時(shí) 生物素缺乏， NH4+影響糖代謝速度：提高糖代謝速度 高效合成谷氨酸 生物素充足時(shí)， NH4+不影響糖代謝速度 ?關(guān)于氮代謝的調(diào)節(jié)： 控制谷氨酸發(fā)酵的關(guān)鍵之一就是降低蛋白質(zhì)的合成能力，使合成的谷氨酸不能轉(zhuǎn)化成其他氨基酸或參與蛋白質(zhì)合成。生成的谷氨酸也不通過(guò)轉(zhuǎn)氨作用生成其他氨基酸和合成蛋白質(zhì)。 d、 VH對(duì)菌體細(xì)胞膜通透性的影響 通常谷氨酸發(fā)酵采用的菌種都是 VH，而 VH又是菌體細(xì)胞膜合成的必須物質(zhì)，因此，可以通過(guò)控制 VH的濃度（ 干擾磷脂中的脂肪酸的生物合成）來(lái)實(shí)現(xiàn)的來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)菌體細(xì)胞膜通透性的調(diào)節(jié) 。 ? 生物素貧乏時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的 Glu含量少而且容易析出，而培 養(yǎng)基中積累大量的 Glu；生物素豐富時(shí)，培養(yǎng)基中幾乎不 積累 Glu，而細(xì)胞內(nèi)卻含有大量的 Glu，且不易被析出。 谷氨酸發(fā)酵的關(guān)鍵在于發(fā)酵培養(yǎng)期間谷氨酸生產(chǎn)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生特異性變化，使細(xì)胞膜轉(zhuǎn)變成有利于谷氨酸向膜外滲透的形態(tài)，使終產(chǎn)物不斷排出細(xì)胞外，胞內(nèi)谷氨酸不能積累到引起反饋調(diào)節(jié)的濃度，胞內(nèi)谷氨酸源源不斷被優(yōu)先合成，分泌到發(fā)酵培養(yǎng)基中積累。 供氧不足： 積累大量的乳酸，使發(fā)酵液的 pH值下降，不利于 GA的產(chǎn)生，同時(shí)，一部分葡萄糖轉(zhuǎn)成了乳酸，影響了糖酸轉(zhuǎn)化率，降低了產(chǎn)物的提出率。 NH4+的供給方式： （ 1）液氨 （ 2）流加尿素 D、磷酸鹽 過(guò)量：（ 1）促進(jìn) EMP途徑，打破 EMP與 TCA之 間的平衡，積累丙酮酸，產(chǎn)生乳酸等 …… （ 2）產(chǎn)生并積累 Val， Glucose 丙酮酸 丙酮酸 + 活性乙醛 α乙酰乳酸 Val Val（ 1）可以抑制葡萄糖 丙酮酸，使 GA的生物合成受到阻止 （ 2）消耗了丙酮酸，降低了糖酸轉(zhuǎn)化率 （ 3）發(fā)酵液中的 Val存在，嚴(yán)重的影響 GA 的結(jié)晶、提出 第五節(jié) 谷氨酸生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制 一、谷氨酸生物合成的調(diào)節(jié) ① 谷氨酸脫氫酶 ② ?酮戊二酸脫氫酶 ③磷酸烯醇丙酮酸羧化酶 ④檸檬酸合成酶 ⑴ 優(yōu)先合成 ? 在微生物的代謝中， Glu比 Asp優(yōu)先合成； 合成過(guò)量時(shí)則抑制谷氨酸脫氫酶，使代謝轉(zhuǎn)向合成 Asp； Asp過(guò)量時(shí)反饋抑制 PEP羧化酶的活力，停止合成草酰乙酸。 當(dāng) α酮戊二酸過(guò)量時(shí) ,將對(duì)異檸檬酸脫氫酶發(fā)生反饋抑制作用 ， 停止合成 α酮戊二酸 。 ⑹磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 PEP受天冬 aa反饋抑制，受谷 aa和天冬 aa反饋?zhàn)瓒? ? 喪失或有微弱的 ?酮戊二酸脫氫酶活力 ， 使 ?酮戊二酸不能繼續(xù)氧化； ? CO2固定能力強(qiáng) ， 使四碳二羧酸全部由 CO2固定反應(yīng)提供 ， 而不走乙醛酸循環(huán)； ? 谷氨酸脫氫酶的活力很強(qiáng) ， 并喪失谷氨酸對(duì)谷氨酸脫氫酶的反饋抑制和反饋?zhàn)瓒?， 同時(shí) ， NADPH2再氧化能力弱 ， 這會(huì)使 ?酮戊二酸到琥珀酸的過(guò)程受阻； ? 有過(guò)量的 NH4+ 存在 ， ?酮戊二酸經(jīng)氧化還原共軛氨基化反應(yīng)而生成谷氨酸卻不形成蛋白質(zhì) ， 從而分泌泄漏于菌體外； ? 同時(shí) ， 谷氨酸生產(chǎn)菌應(yīng)不利用體外的谷氨酸 ， 使谷氨酸成為最終產(chǎn)物 。 二 . 谷氨酸高產(chǎn)菌模型特征 三、谷氨酸生產(chǎn)的代謝調(diào)控 （一）、谷氨酸生產(chǎn)菌的具體育種思路 （谷氨酸代謝控制發(fā)酵的基本方法和實(shí)現(xiàn)的途徑） ⑴選育減弱 α酮戊二酸進(jìn)一步氧化能力的突變株 減弱α酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體的活性，可以使代謝流向谷氨酸，從而使谷氨酸得到積累。但通過(guò) HMP也可生成核糖、核苷酸、莽草酸、芳香族氨基酸、輔酶 Q、維生素 K、葉酸等物質(zhì)。如削弱或切斷這些物質(zhì)的合成途徑，就會(huì)使谷氨酸的產(chǎn)率增加。 ⑶ 選育不分解利用谷氨酸的突變株 （不分解） 積累谷氨酸，必須使菌種不能分解利用谷氨酸，可通過(guò)選育以谷氨酸為唯一碳源，菌體不長(zhǎng)或生長(zhǎng)微弱的突變株來(lái)實(shí)現(xiàn)。減弱乙醛酸循環(huán)， CO2固定反應(yīng)所占的比例就會(huì)增大，谷氨酸的產(chǎn)率就高。 ⑸阻止谷氨酸進(jìn)一步代謝 （不代謝） 細(xì)胞還可以谷氨酸為前體繼續(xù)向下合成谷氨酰胺等，必然導(dǎo)致谷氨酸的積累量減少。 ⑴選育耐高滲透壓突變株 菌種高產(chǎn)谷氨酸 ,應(yīng) 具備在高糖、高谷氨酸的培養(yǎng)基中能正常生長(zhǎng)、代謝的能力，即在高滲培養(yǎng)基中菌體的生長(zhǎng)和谷氨酸的合成不受影響或影響很小。 ⑵選育解除谷氨酸對(duì)谷氨酸脫氫酶反饋調(diào)節(jié)的突變株 谷氨酸合成達(dá)到一定量時(shí)，谷氨酸會(huì)反饋抑制和阻遏谷氨酸脫氫酶，使谷氨酸的合成停止，使代謝轉(zhuǎn)向天冬氨酸的合成。可通過(guò)選育酮基丙二酸抗性、谷氨酸結(jié)構(gòu)類(lèi)似物抗性（如谷氨酸氧肟酸鹽）、谷氨酰胺抗性突變株來(lái)實(shí)現(xiàn)。 ⑵選育強(qiáng)化 CO2固定反應(yīng)的突變株 這可通過(guò)選育以琥珀酸或蘋(píng)果酸為唯一碳源生長(zhǎng)良好的突變株、氟丙酮酸敏感突變株以及丙酮酸或天冬氨酸缺陷突變株來(lái)實(shí)現(xiàn)。 ?生物素缺陷株（生物素亞適量） ⑵選育溶菌酶敏感突變株 。 ⑷選育溫度敏感突變株 谷氨酸溫度敏感突變株的突變位置是在決定與谷氨酸分泌有密切關(guān)系的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)基因上，發(fā)生堿基的轉(zhuǎn)換或顛換，一個(gè)堿基為另一個(gè)堿基所置換，這樣為該基因所指導(dǎo)的酶，在高溫下失活，導(dǎo)致細(xì)胞膜某些結(jié)構(gòu)的改變。 （ 5）油酸缺陷型（油酸亞適量） （ 6）甘油缺陷型（甘油亞適量） 5. 強(qiáng)化能量代謝 谷氨酸高產(chǎn)菌的兩個(gè)顯著特點(diǎn)是 :α酮戊二酸繼續(xù)向下氧化的能力微弱和乙醛酸循環(huán)微弱 ， 使能量代謝受阻 ， TCA循環(huán)前一階段的代謝減慢 。 ⑴ 選育呼吸鏈抑制劑抗性突變株 如可選育丙二酸 、氧化丙二酸 、 氰化鉀 、 氰化鈉抗性突變株來(lái)實(shí)現(xiàn) 。 （ 3） 選育抑制能量代謝的抗生素的抗性突變株 如可選育纈氨霉素 、 寡霉素等抗性突變株來(lái)實(shí)現(xiàn) 。 – 工藝和過(guò)程控制：我國(guó)低糖和中糖發(fā)酵，日本高糖發(fā)酵并流加、提高罐壓，保證溶氧。 一、 谷氨酸生產(chǎn)菌的特征、育種及擴(kuò)大培養(yǎng) （一）、谷氨酸生產(chǎn)菌的主要特征與菌學(xué)性質(zhì) 現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌主要是棒狀桿菌屬 、 短桿菌屬 、 小桿菌屬及節(jié)桿菌屬中的細(xì)菌 。折斷分裂呈八字排列或枷狀排列，不運(yùn)動(dòng) G＋ 好氧或厭氧 葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸，少數(shù)利用乳糖產(chǎn)酸 短桿菌屬 短的不分支直桿菌，多數(shù)不運(yùn)動(dòng)，少數(shù)運(yùn)動(dòng)有鞭毛。 表 1 谷氨酸發(fā)酵微生物特征及菌學(xué)比較 （二）、谷氨酸生產(chǎn)菌形態(tài)與生理的共同特征 ? 細(xì)胞形態(tài)為球形、棒形以至短桿形。 ? 都是生物素缺陷型，需要生物素作為生長(zhǎng)因子 ? 脲酶強(qiáng)陽(yáng)性 ? 不分解淀粉、纖維素、油脂、酪蛋白及明膠 ? 發(fā)酵中菌體發(fā)生明顯形態(tài)變化和細(xì)胞滲透性的變化 ? CO2固定反應(yīng)酶系活力強(qiáng)，異檸檬酸裂解酶活力欠缺或微弱、乙醛酸循環(huán)弱， α 酮戊二酸氧化能力缺失或微弱；檸檬酸合成酶、烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶以及谷氨酸脫氫酶活力強(qiáng)，還原性輔酶 Ⅱ 進(jìn)入呼吸鏈 ? 具有向環(huán)境中泄漏谷氨酸的能力 ? 不分解利用谷氨酸，能耐受高濃度的谷氨酸，產(chǎn)量在5％以上。 斜面培養(yǎng)的菌體較細(xì)小 ， 一 、 二級(jí)種子比斜面菌體大而粗壯 ， 革蘭氏染色深 。 由于生物素充足 ， 繁殖的菌體細(xì)胞均為谷氨酸非積累型細(xì)胞 。 在發(fā)酵中 、 后期感染噬菌體后 ， 菌體細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則 ， 邊緣不整齊 ， 有的邊緣似乎有許多毛刺狀的東西 ， 有細(xì)胞碎片 。 ?生長(zhǎng)特點(diǎn)：糖質(zhì)原料，需氧，以生物素為生長(zhǎng)因子。 ?一級(jí)種子培養(yǎng)：由葡萄糖、玉米漿、尿素、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸鐵及硫酸錳組成。1000ml三角瓶裝量 200－ 250ml，震蕩， 32℃ ，培養(yǎng) 12h。 種子質(zhì)量要求 ? 一級(jí)種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：一級(jí)種子為搖瓶種子。 – 種子營(yíng)養(yǎng)液 pH在 – 種子營(yíng)養(yǎng)液殘?zhí)窃?%以下。對(duì)其質(zhì)量要求 – 平板檢查無(wú)雜菌、無(wú)噬菌體污染，菌體大小均一，呈單個(gè)或八字排列。 – pH在 ， 殘?zhí)呛吭?。 ? 種齡和種量的控制 – 一級(jí)種子控制在 1112h，二級(jí)控制在 78h。過(guò)多，菌體嬌嫩，不強(qiáng)壯，提前衰老自溶，后期產(chǎn)酸量不高。 – 糖化：蒸汽加熱，加壓糖化 25min。 – 中和：燒堿中和，至 – 脫色：活性炭脫色和脫色樹(shù)脂。 ? 酶法：以大米或碎米為原料時(shí)采用 – 調(diào)漿配料：大米進(jìn)行浸泡磨漿，將淀粉乳調(diào)成 15－ 20176。用Na2CO3調(diào) ，用 CaCl2調(diào)節(jié)漿中的 Ca2+至 50mg/L。 – 噴射液化：一次噴射溫度 100－ 105℃ ，層流罐維持 95－ 100℃ ，液化時(shí)間 1h。液化液經(jīng)二次噴射，維持溫度 130－140℃ ，滅酶 5－ 10min，再經(jīng)板式換熱器冷卻至 70℃ 以下，進(jìn)入糖化罐。 1℃ ， ；糖化酶（ 100－ 120u/g，干淀粉計(jì)算 )糖化 – 過(guò)濾：糖液先用 Na2CO3水溶液調(diào) ，過(guò)濾。 – 預(yù)處理方法：活性碳或樹(shù)脂吸附法和亞硝酸法吸附或破壞生物素。 (三 )、谷氨酸發(fā)酵控制 發(fā)酵培養(yǎng)基 碳源：葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖 ?作用： 菌體生長(zhǎng)繁殖；新陳代謝的能源；產(chǎn)生 a硐戊二酸轉(zhuǎn)化為谷氨酸 ?低中糖發(fā)酵：初始糖濃度 %. ?中高糖發(fā)酵： 初始糖濃度 1416%。 目前，較多采用低糖濃度流加發(fā)酵控制。 氮源： 無(wú)機(jī)氮源 : (1)尿素 (2)液氨 (3)碳酸氫銨； 有機(jī)氮源 :玉米漿、麩皮水 解液、豆餅水解液和糖蜜等。 氨水用 pH自動(dòng)控制連續(xù)流加 C:N，谷氨酸發(fā)酵所需比為 100： 15～ 21 無(wú)機(jī)鹽： 磷酸鹽、 硫酸鎂 、 鉀鹽、 微量元素 ? 作用：構(gòu)成細(xì)胞成分，酶的組成成分；激活或抑制酶活性；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基滲透壓；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的 pH；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的氧化還原電位?？刂圃? 硫酸鎂：是已糖磷酸化酶、檸檬酸脫氫酶和羧化酶的激活劑，促進(jìn)葡萄糖 6磷酸脫氫酶活力。 ? 鉀鹽：鉀鹽多，有利于產(chǎn)酸；鉀鹽少，有利于菌體生長(zhǎng) ? 微量元素：主要是錳（許多酶的激活劑）、鐵（細(xì)胞色素、細(xì)胞色素氧化酶和過(guò)氧化氫酶活性基團(tuán)組分，可促進(jìn)谷氨酸產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)）， 106－ 104mol/L。 生長(zhǎng)因子：主要參與細(xì)胞膜的代謝，進(jìn)而影響膜的透性。 – 當(dāng)磷酯含量減少到正常時(shí)的一半左右時(shí)，細(xì)胞發(fā)生變形，谷氨酸能夠從胞內(nèi)滲出，積累于發(fā)酵液中。當(dāng)生物素缺乏時(shí)，菌種生長(zhǎng)緩慢。 成 分 菌種 B9 D110 糖 10 15 玉米漿 ～ ～ 磷酸氫二鈉 硫酸鎂 ～ Fe2＋ 、 Mn2＋ 初 尿 ～ 流加尿 1～ ～ ～ pH 表 4—1 不同生產(chǎn)菌谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基配方 （四） 谷氨酸發(fā)酵工藝控制 溫度對(duì)谷氨酸發(fā)酵的影響 微生物在一定條件下 ， 都有一個(gè)最適的生長(zhǎng)溫度范圍 。 菌體生長(zhǎng)期溫度過(guò)高 ,易造成 菌體衰老 。 在發(fā)酵中 、 后期 ， 菌體生長(zhǎng)基本停止 ， 適當(dāng)提高溫度可促進(jìn)產(chǎn)生谷氨酸 。 即發(fā)酵前期控制在 3032℃ ；中 、 后期 3437℃ 。 ? 控制 pH方法：流加尿素和氨水 ? 流加方式：根據(jù)菌體生長(zhǎng)、 pH變化、糖耗情況和發(fā)酵階段等因素決定 ? 控制： （ 1）菌體生長(zhǎng)或耗糖慢時(shí)，少量多次流加尿素，避免 pH過(guò)高 （ 2）菌體生長(zhǎng)或耗糖過(guò)快時(shí)，流加尿素可多些，以抑制菌體生長(zhǎng)。 （ 4）氨水對(duì) pH影響大，應(yīng)采取連續(xù)流加。一般攪拌器直徑大，轉(zhuǎn)速快，溶氧系數(shù)大。 具體操作： 發(fā)酵前期，以低通風(fēng)量為宜； 發(fā)酵中、后期，以高通風(fēng)量為好。當(dāng)菌體生長(zhǎng)緩慢、 pH偏高時(shí)，應(yīng)減少通風(fēng)量，或停止攪拌，以利于長(zhǎng)菌。 項(xiàng)目 發(fā)酵罐容積 10 m3 20 m3 50 m3 攪拌轉(zhuǎn)速（ r/min） 160 140 110 通風(fēng)比（ m3/ m3 ?發(fā)酵液感染雜菌和噬菌體 （ 2）泡沫對(duì)發(fā)酵的影響 ?發(fā)酵灌的裝料系數(shù)減少 ?氧傳遞系數(shù)減少 ?發(fā)酵液逃液，增加染菌機(jī)會(huì) （ 3）泡沫的消除（控制） ? 調(diào)整培養(yǎng)基的成分（少加或緩加宜起泡的原材料）；改變某些物理化學(xué)參數(shù)（ pH、溫度、通氣和攪拌；改變發(fā)酵工藝 ? 采用機(jī)械消泡或消泡劑消泡 – 機(jī)械消泡：利用機(jī)械振動(dòng)或壓力變化使泡沫破裂 – 消泡劑：屬表面活性劑，天然油脂（豆油、玉米油）；脂肪酸和酯類(lèi)；聚醚類(lèi)（氧化丙烯和氧化乙烯與甘油的聚合物）；硅酮類(lèi) 發(fā)酵過(guò)程主要變化及中間代謝控制 谷氨酸