【正文】 肉膏、氯化鈉組成的 ， 32℃ 培養(yǎng) 1824h。 谷氨酸發(fā)酵過(guò)程中菌體形態(tài)變化及代謝特征 發(fā)酵時(shí)間 /h 細(xì)胞類型 細(xì)胞形態(tài)特征 代謝特點(diǎn) 0－ 8 長(zhǎng)菌形細(xì)胞 菌體形態(tài)與種子相似，短桿、棒形、橢圓形，單個(gè)、成對(duì)，八字形，絕大多數(shù)為 V形分裂 耗糖加快，代謝旺盛，溫度上升，產(chǎn)生 CO2，菌體不產(chǎn)酸 8－ 16 轉(zhuǎn)移期細(xì)胞 細(xì)胞開(kāi)始伸長(zhǎng)、膨大，細(xì)胞邊緣不完整、邊緣褶皺，細(xì)胞形態(tài)急劇變化，由長(zhǎng)菌形細(xì)胞轉(zhuǎn)化成產(chǎn)酸形細(xì)胞 生物素含量由 “ 豐富轉(zhuǎn)向貧乏 ” 通風(fēng)量達(dá)到最大值， OD達(dá)到最大值并穩(wěn)定，放熱也達(dá)到最大值，菌體開(kāi)始產(chǎn)酸 16－ 30 產(chǎn)酸期細(xì)胞 細(xì)胞形態(tài)幾乎都伸長(zhǎng)、膨大，伸長(zhǎng)拉大 2－ 4倍，不規(guī)則，缺乏八字形排列 大量積累谷氨酸，耗糖、好氨與產(chǎn)酸相適應(yīng)，風(fēng)量逐漸下降 三、 菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)和種子的質(zhì)量要求 斜面菌種 一級(jí)種子培養(yǎng) 二級(jí)種子培養(yǎng) 發(fā)酵罐 1. 種子培養(yǎng)過(guò)程 ?菌種：菌種鈍齒棒桿菌和北京棒桿菌及各種誘變株。 谷氨酸發(fā)酵不同階段的菌體形態(tài) 從谷氨酸發(fā)酵中菌體形態(tài)的變化來(lái)看 ， 大致可以分為 長(zhǎng)菌型細(xì)胞 、 轉(zhuǎn)移期細(xì)胞 和產(chǎn)酸型細(xì)胞 3種不同時(shí)期的細(xì)胞形態(tài) . 谷氨酸發(fā)酵感染噬菌體后的菌體形態(tài) 發(fā)酵前期感染噬菌體后 ， 菌體細(xì)胞明顯減少 ， 細(xì)胞不規(guī)則 ， 發(fā)圓 、 發(fā)胖 ,缺乏 “ Ｖ ” 字形排列 ， 有明顯的細(xì)胞碎片 ， 嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)拉絲 、 拉網(wǎng) ， 互相堆在一起 ， 幾乎找不到完整的菌體細(xì)胞 ， 類似蛛網(wǎng)或魚(yú)翅狀 。 多為短桿至棒桿狀 ， 有的微呈彎曲狀 ， 兩端鈍圓 ， 無(wú)分枝 ； 細(xì)胞排列呈單個(gè) 、成對(duì)及 “ V”字形 ， 有柵狀或不規(guī)則聚塊 ； 分裂的細(xì)胞大小為 ～ *～。 （三）、 國(guó)內(nèi)谷氨酸生產(chǎn)菌及其比較 北京棒桿菌 (AS1299)的形態(tài)和生理特征 鈍齒棒桿菌 (AS1542)的形態(tài)和生理特征 天津短桿菌 (T613)的形態(tài)和生理特征 北京棒桿菌 (7338)與鈍齒棒桿菌 (B9)的比較 天津短桿菌 (T613)與鈍齒桿菌 (B9)的比較 目前味精行業(yè)采用的主要菌株 S9114 華南理工大學(xué) FD415 上海復(fù)旦大學(xué) TG961 天津科技大學(xué) 二、 谷氨酸生產(chǎn)菌在發(fā)酵過(guò)程中的形態(tài)變化 種子的菌體形態(tài) 斜面和一 、 二級(jí)種子培養(yǎng)在不同培養(yǎng)條件下 ， 細(xì)胞形態(tài)基本相似 。 ? 革蘭氏染色陽(yáng)性，無(wú)芽孢、無(wú)鞭毛、不運(yùn)動(dòng) ? 都是需氧形微生物，在通氣條件下才能產(chǎn)生谷氨酸。 G＋ 好氧 葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸 小桿菌屬 桿狀，形態(tài)與排列與棒狀桿菌相似 G＋ 好氧 發(fā)酵糖產(chǎn)酸弱，主要產(chǎn)乳酸，不產(chǎn)氣 節(jié)桿菌屬 培養(yǎng)過(guò)程細(xì)胞形態(tài)易變化，先由球菌變桿菌，隨后由桿菌變球菌，不運(yùn)動(dòng) G＋ 變 G－ ，后由 G－ 變G＋ 好氧 發(fā)酵糖產(chǎn)酸極少或不產(chǎn)酸。 1. 棒 狀 桿 菌 屬 (Corynebacterium) ： 谷 氨 酸 棒 桿 核 菌Cornebateium ghotamlkns） (Brevibacterium)：黃色短桿菌 （ Bteuibaterun flavum） 、 乳糖發(fā)酵短桿菌 （ ） (Microbacterium)：嗜氨小桿菌 （ Micrbaterium ammoniaphilmn） (Arthrobacterium) 菌種 形態(tài) G屬性 呼吸類型 碳源基質(zhì) 棒狀桿菌屬 直或微彎，一端膨大。 – 對(duì)溫度、壓力、空氣流量、蛋白質(zhì)、溶氧采用計(jì)算機(jī)控制。 第六節(jié)、谷氨酸的生產(chǎn)工藝 ? 我國(guó)與國(guó)外谷氨酸生產(chǎn)的現(xiàn)狀及存在問(wèn)題 – 菌種的性能：我國(guó)產(chǎn)酸 － 10％，轉(zhuǎn)化率 55％；日本 10－ 12％，轉(zhuǎn)化率 55％。 ⑵ 選育 ADP磷酸化抑制劑抗性突變株 如可選育2,4二硝基酚 、 羥胺 、 砷 、 胍等抗性突變株來(lái)實(shí)現(xiàn) 。 強(qiáng)化能量代謝可彌補(bǔ)上述兩點(diǎn)不足 ， 使 TCA循環(huán)前一段代謝加強(qiáng) ， 谷氨酸合成的速度加快 。當(dāng)控制培養(yǎng)溫度為最適生長(zhǎng)溫度時(shí)，菌體正常生長(zhǎng)；當(dāng)溫度提高到一定程度時(shí)，菌體便停止生長(zhǎng)而大量產(chǎn)酸。 ⑶選育二氨基庚二酸缺陷突變株 。 ⑴選育抗 Vp類衍生物突變株 ?選育抗 Vp類衍生物，如香豆素、盧丁等突變株，都能遺傳性的改變細(xì)胞膜的滲透性。 ⑴選育強(qiáng)化三羧酸循環(huán)中從檸檬酸到 α酮戊二酸代謝的突變株 這可通過(guò)選育檸檬酸合成酶活力強(qiáng)突變株及抗氟乙酸、氟化鈉、重氮絲氨酸、檸檬酸抗性等突變株來(lái)實(shí)現(xiàn)。若解除了谷氨酸對(duì)谷氨酸脫氫酶的反饋調(diào)節(jié)，菌體就會(huì)不斷的合成谷氨酸?？赏ㄟ^(guò)選育耐高糖、耐高谷氨酸及耐高糖 +高谷氨酸突變株來(lái)實(shí)現(xiàn)。要避免谷氨酸被菌體利用，還需要切斷谷氨酸向下的代謝途徑?？赏ㄟ^(guò)選育琥珀酸敏感型突變株、不分解利用乙酸突變株、異檸檬酸裂解酶活力降低菌株實(shí)現(xiàn)。 ⑷選育減弱乙醛酸循環(huán)的突變株 四碳二羧酸是由 CO2固定反應(yīng)和乙醛酸循環(huán)所提供的。可通過(guò)選育莽草酸缺陷型或添加芳香族氨基酸能促進(jìn)生長(zhǎng)的突變株以及抗嘌呤、嘧啶類似物或核苷酸類抗生素，如德夸菌素、狹霉素 C抗性突變株來(lái)實(shí)現(xiàn)。消耗了葡萄糖，使谷氨酸的產(chǎn)率降低。 ⑵選育減弱 HMP途徑后段酶活性的突變株 從葡萄糖到丙酮酸的反應(yīng)由 EMP途徑和 HMP途徑組成。 ? 生產(chǎn)菌株還應(yīng)該具有生物素合成缺陷 、 油酸合成缺陷和甘油合成缺陷等特點(diǎn) 。 異檸檬酸脫氫酶 α酮戊二酸反饋抑制 ⑸ α酮戊二酸脫氫酶 :谷氨酸產(chǎn)生菌中先天性的喪失或微弱。 ⑵ 谷氨酸脫氫酶 (GDH)的調(diào)節(jié) 谷 aa脫氫酶 谷 aa對(duì)其反饋抑制和反饋?zhàn)瓒? ⑶ 檸檬酸合成酶的調(diào)節(jié) 檸檬酸合成酶 TCA的關(guān)鍵酶，受能荷調(diào)節(jié)，谷 aa反饋?zhàn)瓒?，烏頭酸反饋抑制 所以，正常代謝不積累 Glu ⑷ 異檸檬酸脫氫酶的調(diào)節(jié) 細(xì)胞內(nèi) α酮戊二酸的量與異檸檬酸的量需維持平衡 。 C、 NH4+濃度 （ 1）影響到發(fā)酵液的 pH值 （ 2）與產(chǎn)物的形成有關(guān)： 過(guò)低，不利于 αKGA的還原氨基化；過(guò)高，產(chǎn)生谷氨酰胺。 B、供氧濃度 過(guò)量： NADPH的再氧化能力會(huì)加強(qiáng)，使 αKGA的還原氨基化受到影響，不利于 GA 的生成。 這說(shuō)明生物素對(duì)細(xì)胞膜通透性有重要影響。 葡萄糖 丙酮酸 + 丙酮酸 乙酰輔酶 A 乙酰輔酶Ａ 乙酰輔酶 A羧化酶 （ 輔酶是 VH ） CO2 丙二酰輔酶 A 丙二酰輔酶 A C4 C6 CO2 培養(yǎng)基中生物素限量時(shí)，胞內(nèi) AA 92% 胞外 培養(yǎng)基中生物素豐富時(shí)，胞內(nèi) AA 12% 胞外 CO2 ? Glu生產(chǎn)菌大多是生物素缺陷型，發(fā)酵時(shí)控制生物素亞適 量，使細(xì)胞變形拉長(zhǎng)，改變了細(xì)胞膜的通透性引起代謝失 調(diào)使 Glu得以積累。 ?在生物素充足的條件下，異檸檬酸裂解酶活性增強(qiáng)，琥珀酸氧化能力增強(qiáng)，丙酮酸氧化力加強(qiáng)，乙醛酸循環(huán)的比例增加，草酰乙酸、蘋(píng)果酸脫羧反應(yīng)增強(qiáng)，蛋白質(zhì)合成增強(qiáng)，谷氨酸減少，合成的谷氨酸通過(guò)轉(zhuǎn)氨作用生成的其他氨基酸量增加。 ?在生物素亞適量的情況下，幾乎沒(méi)有異檸檬酸裂解酶，琥珀酸氧化能力弱，蘋(píng)果酸和草酰乙酸脫羧反應(yīng)停滯，在銨離子適量存在下，生成積累谷氨酸。 b、控制 VH的濃度，以實(shí)現(xiàn)對(duì)于乙醛酸循環(huán)的封閉 c、生物素對(duì)氮代謝的影響 VH豐富時(shí)，出現(xiàn)“ 只長(zhǎng)菌，不產(chǎn)酸 ”的現(xiàn)象 GA發(fā)酵過(guò)程中，前期，菌體的增殖期，一定的量的生物素是菌體增殖所必需的；而在產(chǎn)物合成期，則要限制生物素的濃度，以保證產(chǎn)物的正常合成。生物素充足的條件下，丙酮酸以后的氧化活性雖然也得到提高，但由于糖降解速度顯著提高，打破了糖降解速度與丙酮酸氧化速度之間的平衡，丙酮酸趨于生成乳酸的反應(yīng)，引起乳酸的溢出。目前，國(guó)內(nèi)的 GA生產(chǎn)企業(yè)的糖酸轉(zhuǎn)化率通常都在 50%以內(nèi)： 提高 GA的潛力是很大的，具體表現(xiàn)在： （ 1）強(qiáng)化 CO2固定反應(yīng)，具體措施： Mn+ ，生物素？ （ 2）控制溶氧濃度是非常重要的 低的溶氧濃度，則丙酮酸向乳酸方向轉(zhuǎn)化 …… 高的溶氧濃度，則 NADPH 有被氧化的可能， …… 氨的導(dǎo)入 合成谷氨酸的反應(yīng)有 3種： α酮戊二酸 + 天冬氨酸或丙氨酸 谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶 AT 谷氨酸 α酮戊二酸 + α 酮戊二酸 + 谷氨酰胺 NADPH + 2谷氨酸 NADP + 谷氨酸合成酶 GS α酮戊二酸 NH4+ NADPH 谷氨酸 H2O NADP + 谷氨酸脫氫酶 GHD + + + （ 2）影響谷氨酸合成的外在因素 a、生物素對(duì)糖代謝的影響 生物素參與糖代謝作用： 增加糖代謝的速度 (對(duì) TCA有促進(jìn)作用） 乳酸積累 碳源利用率降低，發(fā)酵液的 pH值下降。 氨基酸發(fā)酵是典型的代謝控制發(fā)酵 ， 發(fā)酵技術(shù)的關(guān)鍵是 打破微生物的正常代謝調(diào)節(jié) ， 人為控制微生物的代謝 。 消除終產(chǎn)物的反饋抑制與阻遏作用 – 使用抗氨基酸結(jié)構(gòu)類似物突變株的方法或者通過(guò)選育營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。 ? 青霉素：抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的后期合成，形成不完整的細(xì)胞壁，使細(xì)胞膜失去保護(hù)，使胞內(nèi)外的滲透壓差導(dǎo)致細(xì)胞膜的物理?yè)p傷，增大谷氨酸向胞外漏出的滲透性、 生物素 阻斷脂肪酸的合成 影響細(xì)胞膜的合成 表面活性劑 對(duì)生物素有拮抗 阻斷脂肪酸的合成 影響細(xì)胞膜的合成 在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期添加青霉素 抑制細(xì)胞壁合成 細(xì)胞膜損傷 甘油缺陷型 磷脂的合成受阻 影響細(xì)胞膜的合成 油酸缺陷型 阻斷不飽和脂肪酸的合成 影響細(xì)胞膜的合成 提高細(xì)胞膜的 谷氨酸通透性 控制磷脂的合成 使細(xì)胞膜受損（如表面活性劑） 青霉素?fù)p傷細(xì)胞壁，間接影響細(xì)胞膜 控制磷脂含量 通過(guò)油酸的合成 通過(guò)甘油合成 直接控制磷脂合成 控制旁路代謝 降低反饋?zhàn)饔梦锏臐舛? ? 利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株進(jìn)行氨基酸發(fā)酵必須限制所要求的氨基酸的量。 限量供應(yīng)， 控制了細(xì)胞膜中與滲透性直接關(guān)系的磷脂含量，使谷氨酸排出胞外而積累。 ? 生物素：影響磷脂的合成及細(xì)胞膜的完整性。 ?細(xì)胞內(nèi)生物素水平高， Glu不能通過(guò)細(xì)胞膜 ?青霉素：抑制細(xì)胞壁的合成，由于細(xì)胞面內(nèi)外的滲透壓而泄露出來(lái)。 第三節(jié) 氨基酸發(fā)酵的代謝控制 ? 控制發(fā)酵的條件 ? 控制細(xì)胞滲透性 ? 控制旁路代謝 ? 降低反饋?zhàn)饔梦锏臐舛? ? 消除終產(chǎn)物的反饋抑制與阻遏作用 ? 促進(jìn) ATP的積累，以利氨基酸的生物合成 一、菌種的代謝調(diào)控 是氨基酸代謝控制發(fā)酵的基本策略之二 控制發(fā)酵環(huán)境條件 – 專性需氧菌，控制環(huán)境條件可改變代謝途徑和產(chǎn)物。 ? 電轉(zhuǎn)化方法由于高效，快速被廣泛使用，目前它的轉(zhuǎn)化效率可達(dá)到原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法的 1001000倍。 基因轉(zhuǎn)移手段 ? 通常采用的方法有 :原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)，電轉(zhuǎn)化，接合轉(zhuǎn)移。 載體的構(gòu)建 ? 有效的載體需要有在受體菌中可啟動(dòng)的復(fù)制起始位點(diǎn)，這可從棒狀桿菌家族內(nèi)源小質(zhì)粒中獲得 。 ? 大腸桿菌遺傳背景研究得清楚，載體系統(tǒng)完善，利于工程菌的構(gòu)建，但它含有內(nèi)毒素且不能將蛋白產(chǎn)物分泌至胞外，為應(yīng)用帶來(lái)困難。 ? 使調(diào)節(jié)元件的作用及培育條件最優(yōu)化。 ? 取得酶基因，必要時(shí)可用蛋白質(zhì)工程技術(shù)，如定點(diǎn)誘變，基因剪接等，使蛋白具有新的特點(diǎn) (增強(qiáng)活性或穩(wěn)定性、解除反饋抑制等 )。 代謝工程 在闡明代謝途徑及其調(diào)控規(guī)律的基礎(chǔ)上，應(yīng)用重組 DNA技術(shù)可以改變代謝途徑分支點(diǎn)上的流量或引入新的代謝步驟與構(gòu)建新的代謝網(wǎng)絡(luò)。 ? 體內(nèi)基因重組在應(yīng)用上又稱為雜交育種，主要方法包括：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、接合轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞融合等，這都是在細(xì)胞內(nèi)暫時(shí)地產(chǎn)生染色體的局部二倍體，在兩條 DNA鏈之間引起兩次以上的交叉，是遺傳性重組現(xiàn)象。 高絲氨酸脫氫酶 ? 例如，在黃色短桿菌的賴氨酸、蘇氨酸和異亮氨酸生物合成中（圖 516所示），選育抗蘇氨酸結(jié)構(gòu)類似物 2氨基 3羥基戊酸（ AHVr）突變株，得到了具有反饋抑制抗性，高絲氨酸脫氫酶活性提高 1300倍，能積累 14g/L蘇氨酸的突變株。這樣，就可以得到在這種培養(yǎng)基中能夠生長(zhǎng)的變異株，而這種變異株正是解除了調(diào)控機(jī)制的，能夠生成過(guò)量的氨基酸。在限量供給蘇氨酸的情況下，即使賴氨酸過(guò)剩，抑制作用也很難發(fā)生。 谷氨酸棒狀桿菌的蘇氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸和賴氨酸的合成是與分枝途徑相聯(lián)系的 (圖 48)，篩選高絲氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型后，限量供給蘇氨酸時(shí)，就能解除由蘇氨酸和賴氨酸的協(xié)同反饋抑