【正文】 ，有好處，就會(huì)被保存下來(lái)，甚至得到擴(kuò)展；如果沒(méi)有用就有可能會(huì)被刪除。有人說(shuō)次級(jí)代謝好像是有機(jī)物代謝演變的“操場(chǎng)”，這是有一定道理的。顯然，這是因?yàn)榇渭?jí)代謝所涉及的某些酶的特異性比初級(jí)代謝的酶的特異性要低得多。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 93 次級(jí)代謝產(chǎn)物種類(lèi)很多，然而，它們的結(jié)構(gòu)單位主要是莽草酸（ SMA）、氨基酸 （ arAA 和 alAA ） 和乙酸（ AcCoA），也就是說(shuō)它們可以 從莽草酸、某些氨基酸和 AcCoA等通過(guò)（有條件誘導(dǎo)的 ）次級(jí)代謝途徑來(lái)合成： 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 94 Glu G6P PEP PYR AcCoA R5P E4P 糖類(lèi)次生代謝產(chǎn)物（氨基糖苷類(lèi)抗生素），核酸堿基類(lèi)次生代謝產(chǎn)物 arAA alAA SMA 其他次生代謝產(chǎn)物 多肽類(lèi)次生代謝產(chǎn)物（如 β內(nèi)酰胺類(lèi)環(huán)肽類(lèi)抗生素、生物堿類(lèi)） 聚酯類(lèi)次生代謝（如類(lèi)異戊二烯化合物、甾類(lèi)化合物、類(lèi)胡蘿卜素、大環(huán)抗生素） TCA 環(huán) 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 95 次級(jí)代謝產(chǎn)物的存在已引起人們特別注意。 關(guān)于“進(jìn)”、“出”、“堵”的策略應(yīng)用也都有成功的實(shí)例。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 91 “通”的實(shí)施： 賴(lài)氨酸的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物 S（ βaminoethyl） LCys， 簡(jiǎn)稱(chēng) AEC，是最早用于氨基酸育種并取得明顯效果的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物。 根據(jù)對(duì) FP超敏程度的不同，選得不同程度的 PD缺損株（ PD的不同程度的低水平株 ），從中找到了 PD水平低到恰到好處的突變株，既不過(guò)分削弱 PD 以提供足夠的代謝能，又能使碳架物質(zhì)較多地流向 OAA 以合成更多的Lys。 PYR是與生長(zhǎng)密切相關(guān)的丙酮酸脫氫酶（ PD ） 的底物，如果用葡萄糖為唯一碳源， PD 是唯一通向 AcCoA和 TCA環(huán)的通道，若 PD 完全阻塞，微生物就無(wú)法通過(guò) TCA環(huán)和電子傳遞獲得代謝能，有關(guān)的合成代謝也無(wú)法進(jìn)行。 酶水平低，代謝流的通道就窄，就意味著“ 節(jié) ”（節(jié)流）。這種敏感性的大小與酶水平的高低相關(guān) ，敏感性小的菌株酶水平高，敏感性大的菌株酶水平低，特別敏感的（超敏的）的菌株酶水平最低。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 88 從結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的超敏性突變株中獲得高產(chǎn)菌株是可行的，但必須注意 這里 “ 結(jié)構(gòu)類(lèi)似物 ” 是指酶的底物的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，前述的“酶” 必須是與微生物的生長(zhǎng)密切有關(guān)的酶。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 86 AMINO ADIPIC ACID PATHWAY Glc PYR α KG HICA αAAA Penicillin G αAAAεSA Lys Lys I Lys R IPenicillin N αAAALCysDVal αAAALCys Penicillium chrysogenum 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 87 Ⅳ .應(yīng)用“五字策略”的實(shí)施 “節(jié)” 的成功實(shí)施： 若以 黃色短桿菌 為出發(fā)菌株，選育 LLys 高產(chǎn)菌種，可采用 高絲氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株 。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 84 Glc PYR αKG OAA Asp AspβSA β AspP DDP Lys Glu HSer Met Thr Ile （ AK） ( HD ) (Thr+Lys) I Thr I Met R DIAMINOPIMERIC ACID PATHWAY PEP G6P Asn HMP PYR PYR Leu R Leu Brevibacterium lactofermentum 細(xì)胞外 細(xì)胞內(nèi) 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 85 生物合成途徑同一性的一個(gè)例外：賴(lài)氨酸的生物合成途徑在細(xì)菌是 二氨基庚二酸途徑 ，在真菌中是 氨基己二酸途徑 。綠色箭頭連接成的路徑為用葡萄糖為主要碳源時(shí)的 理想載流路徑 。因此 芳香族氨基酸合成代謝流是跨代謝網(wǎng)絡(luò)的中心板塊和離心板塊的 。其載流路徑的上游部分從葡萄糖起到磷酸烯醇式丙酮酸和 4磷酸赤蘚糖止，以后為下游部分。因此 天冬氨酸族氨基酸合成代謝流是跨代謝網(wǎng)絡(luò)的中心板塊和離心板塊的 。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 76 微生物細(xì)胞以葡萄糖為原料合成天冬氨酸族氨基酸時(shí)，碳架物質(zhì)通過(guò)代謝網(wǎng)絡(luò)的載流路徑流向目的產(chǎn)物， 其載流路徑的上游部分從葡萄糖起到草酰乙酸止，草酰乙酸以后為下游部分。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 75 Ⅲ .有關(guān)代謝途徑的流量調(diào)節(jié)的分析 以天冬氨酸族氨基酸的合成代謝為例，來(lái)討論代謝途徑的流量調(diào)節(jié)。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 74 單考慮細(xì)胞內(nèi)的碳架物質(zhì)等的代謝是不夠的，至少還必須考慮營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞及目的產(chǎn)物排出細(xì)胞的問(wèn)題，也就是碳架物質(zhì)通過(guò)細(xì)胞膜的問(wèn)題。以糖質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸的過(guò)程至少依次包括糖質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞、經(jīng)過(guò)代謝在胞內(nèi)生成目的氨基酸和目的氨基酸被分泌至培養(yǎng)基 3 個(gè)階段。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 72 在育種和發(fā)酵控制方面加強(qiáng)“出”的辦法很多，如調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)目的產(chǎn)物的通透性，增加輸送目的產(chǎn)物的載體蛋白的量，為目的產(chǎn)物的主動(dòng)輸送提供代謝能等，都能使在胞內(nèi)生成的目的產(chǎn)物盡快的轉(zhuǎn)移出細(xì)胞，降低其細(xì)胞中的濃度；為了進(jìn)一步降低細(xì)胞中目的產(chǎn)物的濃度，還可能根據(jù)目的產(chǎn)物的理化性質(zhì)，采用邊發(fā)酵邊分離目的產(chǎn)物的工藝，不斷的將目的產(chǎn)物從反應(yīng)器中轉(zhuǎn)移出去，給代謝主流一個(gè)“拉動(dòng)力”。胞內(nèi)目的產(chǎn)物的濃度過(guò)高，就會(huì)對(duì)合成目的產(chǎn)物的代謝過(guò)程施加負(fù)反饋調(diào)節(jié)，迫使其回到正常濃度。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 71 出 ：促進(jìn)目的產(chǎn)物向胞外空間分泌。若不能對(duì)菌株進(jìn)行有效的改造，也可以通過(guò)工藝手段來(lái)達(dá)到堵的目的。如果菌株生產(chǎn)目的產(chǎn)物的途徑暢通，但同時(shí)目的產(chǎn)物進(jìn)一步代謝（包括目的產(chǎn)物參與的分解代謝和合成代謝）的途徑也暢通，或者隨著生產(chǎn)的進(jìn)行目的產(chǎn)物進(jìn)一步的代謝加強(qiáng)，都會(huì)最終影響目的產(chǎn)物的溢出代謝，降低工業(yè)發(fā)酵的效益。因此，不是目的產(chǎn)物生產(chǎn)所必需的途徑，應(yīng)做到不同程度的關(guān)閉，也就是“節(jié)”。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 67 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 68 經(jīng)過(guò)千千萬(wàn)萬(wàn)年的物競(jìng)天擇，微生物細(xì)胞已經(jīng)成為自我保障的經(jīng)濟(jì)體系。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 66 節(jié) ：采用育種或發(fā)酵控制手段，節(jié)制載流路徑上與目的產(chǎn)物的形成無(wú)關(guān)或關(guān)系不大的代謝支流，使碳架物質(zhì)相對(duì)集中地流向目的產(chǎn)物。當(dāng)然，合成途徑中的任何一個(gè)限制因子，都可能產(chǎn)生類(lèi)似的情況。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 64 這些酶包括用于目的產(chǎn)物自身合成的酶（如下圖中酶①～⑤）和用于目的產(chǎn)物的前體合成的酶（ 如下圖中酶和⑥，用于前體 C的合成，酶⑦⑧，用于前體 D的合成）。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 63 通 ：在育種方面，解除對(duì)途徑中某些酶的反饋調(diào)節(jié)；在發(fā)酵控制方面，誘導(dǎo)這些酶的合成或激活這些酶，從而使來(lái)自各代謝物流（除碳架物流外還包括其他支持生物合成的物流）能夠暢通地注入載流路徑，匯入代謝主流，流向目的產(chǎn)物。為了消除底物在培養(yǎng)過(guò)程中的抑制作用，有的還采用流加的培養(yǎng)方法。在發(fā)酵過(guò)程中，一般都希望菌體能迅速達(dá)到一定的濃度，因此，就必需選用生長(zhǎng)旺盛的菌株，這類(lèi)菌株吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力往往也較強(qiáng)。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 60 N P P 進(jìn) 出 通 節(jié) 堵 工業(yè)發(fā)酵的“五字策略” 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 61 高產(chǎn)菌種的代謝特征：不同來(lái)源的碳架物質(zhì)暢通地“注入”載流路徑，高速生成并順利釋出目的產(chǎn)物，如下圖?！? 五字策略 ” 就是從合作的良好愿望出發(fā)，發(fā)揮人的主觀能動(dòng)作用，主動(dòng)與微生物合作實(shí)現(xiàn)工業(yè)發(fā)酵效益的策略。載流途徑的五段式和代謝主流的五段式統(tǒng)稱(chēng)為 微生物代謝的五段式 。 因此有 載流路徑的五段式 之稱(chēng)。 在發(fā)酵工程領(lǐng)域， “載流路徑”作為發(fā)酵工程的專(zhuān)用術(shù)語(yǔ)，被定義為從主要有機(jī)原料到目的產(chǎn)物一組載流途徑的有序組合。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 57 “載流途徑”泛指承載代謝物流的代謝途徑。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 56 Ⅰ . 初級(jí)代謝產(chǎn)物過(guò)量合成的五字策略 在分析細(xì)胞機(jī)器的生產(chǎn)運(yùn)行時(shí)，可把它看作是分步進(jìn)行的過(guò)程。 初級(jí)代謝產(chǎn)物合成的途徑是穩(wěn)定的，不同微生物物種的調(diào)節(jié)機(jī)制是可以弄清楚或基本弄清楚的，這就是對(duì)這種合成代謝流“治理”的基礎(chǔ)。初級(jí)途徑上的酶的特異性比次級(jí)代謝的酶的特異性要高。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 54 初級(jí)代謝產(chǎn)物都是從中心代謝途徑的中間產(chǎn)物（ 12種前體代謝物）開(kāi)始合成的。 工業(yè)發(fā)酵呼喚人與微生物的合作，而在合作中，人處于主導(dǎo)的地位，人應(yīng)該發(fā)揮主觀能動(dòng)作用。而人類(lèi)因自我發(fā)展的需要，卻希望微生物能夠大量地合成能滿足人類(lèi)需求為目的產(chǎn)物（微生物的代謝產(chǎn)物）。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 51 在物競(jìng)天擇的基礎(chǔ)上建立的細(xì)胞經(jīng)濟(jì)體系已經(jīng)經(jīng)受長(zhǎng)期的實(shí)踐檢驗(yàn)，并已成為微生物細(xì)胞生命活動(dòng)的保障體系。 從而建立了 生物機(jī)器 （又稱(chēng) 細(xì)胞機(jī)器 ）工作的基本模式。在發(fā)酵工廠的生產(chǎn)線上，微生物必須完成微生物細(xì)胞機(jī)器的 在線制造（細(xì)胞增殖）和生產(chǎn)運(yùn)行（目的產(chǎn)物的合成和輸出）的雙重任務(wù)。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 48 現(xiàn)代發(fā)酵工程依靠微生物活細(xì)胞來(lái)完成發(fā)酵工廠生產(chǎn)線上不可缺少的加工（或轉(zhuǎn)化）步驟，在這個(gè)意義上， 微生物活細(xì)胞就是工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)線上不可缺少的微生物生物機(jī)器（或稱(chēng)細(xì)胞機(jī)器） ，是發(fā)酵工廠里關(guān)鍵的生產(chǎn)機(jī)器。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 47 代謝流“治理”的可能性和 現(xiàn)實(shí)性 代謝流具有流體流動(dòng)的基本屬性，因此具有“治理”的可能性；微生物代謝的變動(dòng)性和微生物遺傳的保守性，加上人的主觀能動(dòng)性，能使可能變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 46 從以上實(shí)例可以看到，溢出代謝的發(fā)生，不但要求微生物本身具有相應(yīng)的遺傳根據(jù)，還必須具備相應(yīng)的環(huán)境條件。從而導(dǎo)致生成乙醇的溢出代謝。輔酶 NADH 和輔基 FADH2 完全可以在電子傳遞鏈釋放電子而得到再生。這些途徑運(yùn)行中形成的 NADH和FADH2分子上的電子需經(jīng)電子傳遞鏈（呼吸鏈）傳遞給分子氧。因此瓶頸是對(duì)生物氧化中呼吸鏈電子傳遞通道的相對(duì)狹窄而言的。后來(lái)才認(rèn)識(shí)到，釀酒酵母之所以在葡萄糖培養(yǎng)基中累積乙醇，是因?yàn)樵撐⑸镉邢薜暮粑芰?，并把這種現(xiàn)象稱(chēng)為瓶頸效應(yīng)（ bottleneck effect）。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 41 ⑵ 乙醇的溢出代謝： 葡萄糖為碳源，對(duì)釀酒酵母進(jìn)行批式培養(yǎng)，出現(xiàn)二段生長(zhǎng)（ two growth phase） 現(xiàn)象：在 第一階段 ，葡萄糖濃度較大，萄萄糖的消耗伴隨著 乙醇的產(chǎn)生 ；第二階段，葡萄糖濃度下降到某值以下， 乙醇被氧化 。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 40 ③ 在檸檬酸過(guò)量合成階段，培養(yǎng)基的 pH 值 顯然會(huì)影響細(xì)胞膜對(duì)目的產(chǎn)物檸檬酸和的跨膜輸送；檸檬酸的分泌也會(huì)影響 培養(yǎng)基的 pH 值 。 這能力由兩個(gè)因素構(gòu)成。此外，檸檬酸的分泌降低其胞內(nèi)濃度。這個(gè)能力由 3 個(gè)因素構(gòu)成。 檸檬酸的溢出代謝是黑曲霉特有的遺傳和生化機(jī)制與培養(yǎng)條件共同起作用的結(jié)果。研究檸檬酸溢出代謝的最好的例子無(wú)疑是黑曲霉。 這里介紹兩個(gè)溢出代謝的實(shí)例： ⑴ TCA環(huán)中間產(chǎn)物檸檬酸的溢出代謝， ⑵導(dǎo)致能量代謝的副產(chǎn)物乙醇生成的溢出代謝。 2022/6/3 張星元：發(fā)酵原理 35 溢出代謝 發(fā)生溢出代謝（ overflow metabolism）的原因是，代謝途徑前段的運(yùn)轉(zhuǎn)速率大于后段的運(yùn)轉(zhuǎn)速率。 兼性厭氧微生物細(xì)胞在缺氧的條件下，以變通的方式實(shí)現(xiàn)還原力的平衡和輔酶的再生和回用，使細(xì)胞的能量代謝得以維持，與此同時(shí)形成并分泌出能量代謝副產(chǎn)物。因此， 研究微生物過(guò)量合成指定的初級(jí)代謝產(chǎn)物的機(jī)理，就是研究工業(yè) 微生物的病理學(xué) 。對(duì)微生物進(jìn)行遺傳改造，就是要 修正原有的生產(chǎn)關(guān)系。細(xì)胞固有的生產(chǎn)關(guān)系支持細(xì)胞自身的增殖（