電泳技術(shù)方王楷ppt課件-資料下載頁
2025-05-01 18:13本頁面
【正文】 ＋ H＋ COO－ 蛋白質(zhì)的陽離子 蛋白質(zhì)的兼性離子 蛋白質(zhì)的陰離子 以聚丙烯酰胺作為支持物，兩性電解質(zhì)（ A m p h o l i n e ）在支持物內(nèi)形成穩(wěn)定的 pH 梯度，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在電場力的作用下，便會在支持物中運(yùn)動到相當(dāng)于自身 pH 梯度中聚合成一狹窄的區(qū)帶而停留。 因?yàn)?A m p h o l i n e 形成的 pH 梯度是一較平滑的穩(wěn)定的 pH 梯度，從理論上講，只要蛋白質(zhì)的 pI 相差 0 . 0 1 就可分離。 血紅蛋白的pI 約在 6 . 9 ，細(xì)胞色素 C 的 pI 為 10 . 5 ，兩者的 pI 相差較大，可以得到較好的分離。 操作步驟及注意要點(diǎn) 凝膠配制 ： a 取 10 ，從一端量出 7cm作好標(biāo)記，用橡皮片封底（ 用兩條橡皮圈扎緊 ），垂直放置。 b 按實(shí)驗(yàn)指導(dǎo) page 17 配制凝膠液（ 按順序，每加一種試劑后都要輕輕充分搖勻， TEMED最后才加入，加入搖勻后要立即灌膠 ），用長滴管吸取配好的凝膠液，沿玻璃管注入至7 ml標(biāo)記平面，緩緩注入， 避免產(chǎn)生氣泡 。 c 立即用 5ml注射器配針頭注入約 ，垂直放置（ 將長滴管及時清洗 ） 注意：丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是神經(jīng)毒劑，對皮膚有刺激作用，注意避免直接接觸。 電 泳 將已聚合的凝膠去除水層，垂直插入電泳槽的橡皮管中，注意不要漏液 。上槽注入 5%H3PO4， 下槽注入 2%NaOH，檢查凝膠管上下口內(nèi)有無氣泡 ，如有必須排除。 上槽接正極 ， 下槽接負(fù)極 ， 50V預(yù)電泳 30min，然后將電壓維持在 250 V，電泳 2小時 。 剝 膠 用帶有針頭的注射器吸入蒸餾水，將針頭插入凝膠與水之間，使針頭慢慢螺旋前進(jìn)?？克鲏毫⒛z與玻璃管分開，最后可用吸耳球在一端輕輕施壓，將其取下。 測 量 樣 品 pI 直接用 pH試紙插入所需測定的蛋白區(qū)帶中測量
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