【導(dǎo)讀】個綜合性技術(shù)體系。因工程是生物技術(shù)的核心。2020年，中國的重組腺病毒-p53注射液成為石階上第一個正式批準的基因治療藥物。物、植物或動物來生產(chǎn)所需的醫(yī)藥品。然生化藥物、微生物藥物、海洋藥物和生物制品共同歸為生物藥物。物；天然藥物；合成與部分合成藥物。性效應(yīng)；檢驗的特殊性。種，產(chǎn)生新的微生物藥物⑦改進藥物生產(chǎn)工藝⑧利用轉(zhuǎn)基因動、植物生產(chǎn)蛋白質(zhì)類藥物。但是，cDNA只包含蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因部分，缺少有關(guān)的調(diào)控序列，因此在原核。應(yīng)鑒定法從數(shù)以萬計的DNA片段中篩選出目的基因。蛋白質(zhì)不能糖基化。單倍體雙倍體兩種形式，繁殖迅速，無毒性。

　　

【正文】 1,5二氟 2,4二硝基苯。 （ 3）包埋法： ①網(wǎng)格型：將酶或細胞包埋在高分子凝膠細微網(wǎng)格中。常用合成高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏樹脂。天然高分子化合物有淀粉、明膠、膠原、海藻膠、角叉菜膠。多用于固定化細胞。 ②微囊型：將酶或細胞包埋在高分子半透膜中。通常為直徑幾微米到幾百微米的球狀體。 （ 4）無載體法（選擇性熱變性法）：在適當溫度下處理使細胞膜蛋白變性，但酶不變性使酶固定于細胞內(nèi)。此法只適用于細胞固定化。 固定化酶的性質(zhì)（變化 ） P228 （ 1）酶活力的變化：酶經(jīng)過固定化之后活力大都下降。 （ 2）酶穩(wěn)定性的變化：包括對溫度、 pH、蛋白酶變性劑和抑制劑的耐受程度。固定化后，穩(wěn)定性提高，有效壽命延長。其原因是限制了酶分子之間的相互作用，阻止了其自溶，增加了酶構(gòu)型的牢固程度。 （ 3）酶學(xué)特性的變化 ①底物專一性：對底物的專一性下降。②最適 pH：最適 pH 可能變大，也可能變?。虎圩钸m溫度：一般升高。原因是固定化后空間結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定。④米氏常數(shù) (Km)： Km 值均發(fā)生變化，有的增加很小，有的增加很大，但不會變小。⑤最大反應(yīng)速度（ Vm）：變化很小 或不變。 固定化酶活力測定方法：分批測定法和連續(xù)測定法。 P231 第三節(jié) 固定化酶和固定化細胞的反應(yīng)器 反應(yīng)器的類型和特點 P232 （ 1）間歇式攪拌罐反應(yīng)器：用于游離酶反應(yīng)后隨即放料。 （ 2）連續(xù)流動攪拌罐反應(yīng)器：連續(xù)進料、連續(xù)出料 （ 3）填充床反應(yīng)器： 固定化酶填充于床層內(nèi)。反應(yīng)器內(nèi)的流體的流動形態(tài)為平推流形。 底物以恒定流速通過反應(yīng)床。 （ 4）流化床反應(yīng)器：底物以足夠大的流速向上通過固定化酶床層，使固體顆粒處于流化狀態(tài)，達到混合的目的。 （ 5）循環(huán)反應(yīng)器：部分反應(yīng)液流出和新加入底物流入液混合， 在進入反應(yīng)床進行循環(huán)。 （ 6）連續(xù)流動攪拌罐 超濾膜反應(yīng)器 （ 7）其它反應(yīng)器 第四節(jié) 酶的人工模擬 人工模擬酶：根據(jù)酶的作用原理，用各種方法人為制造的均有酶性質(zhì)的催化劑。它們一般具有高效和高適應(yīng)性的特點，在結(jié)構(gòu)上相對天然酶簡單。 P235 主 客體化學(xué)和超分子化學(xué)是酶人工模擬的重要理論基礎(chǔ)。 P236 模擬酶的分類 P236 （ 1）根據(jù) Kirby 分類法：單純酶模型、機理酶模型、單純合成的酶樣化合物 （ 2）主 客體酶模型：主 客體酶（環(huán)糊精 CD）、膠束酶模型、肽酶、分子印跡酶模型、半合成酶 何謂分 子印跡？分子印跡的應(yīng)用范圍有哪些？ P238 分子印跡 ：指制備對某一特定分子具有選擇性的聚合物的過程，該特定分子稱為印跡分子或模板。 分子印跡的應(yīng)用范圍有：① 分子印跡聚合物可作為裁剪分離物質(zhì)的材料，如手性藥物的分離，也可以分離大分子物質(zhì)。② 在酶技術(shù)和有機合成中，分子印跡聚合物可作為模擬抗體，模擬酶或具有催化活性的聚合物。③ 分子印跡聚合物還可在生物傳感器的構(gòu)建中作為傳感器，這種聚合物可作為通常使用的生物材料的替代物。 第五節(jié) 酶的化學(xué)修飾 為什么要對酶進行化學(xué)修飾 ? P242 酶作為生物催化劑，其高 效性和專一性是其他催化劑所無法比擬的。但是，酶是蛋白質(zhì)，存在其異體蛋白的抗原性、受蛋白酶水解和抑制劑作用、在體內(nèi)半衰期短等缺點，嚴重影響使用效果。工業(yè)用酶常常由于酶蛋白抗酸、堿、有機溶劑變性及抗熱失活能力差，容易受產(chǎn)物和抑制劑的抑制，工業(yè)反應(yīng)要求的 pH 和溫度不總在酶反應(yīng)的最適 pH 和最適溫度范圍內(nèi)，底物不溶于水或酶的 Km 值過高等弱點，限制了酶制劑的應(yīng)用范圍。酶的化學(xué)修飾就是對酶在分子水平上用化學(xué)方法進行改造，從而提高酶的穩(wěn)定性、解除酶的抗原性、改變酶學(xué)性質(zhì)、擴大酶的應(yīng)用范圍。 酶化學(xué)修飾：通過化學(xué)方法對酶 分子的主鏈進行切割、剪接和側(cè)鏈基團的化學(xué)修飾改造，以改變其理化性質(zhì)和生物活性。 P242 化學(xué)修飾的目的：人為地改變天然酶的一些性質(zhì)，創(chuàng)造天然酶所不具備的某些優(yōu)良特性甚至創(chuàng)造出新活性，來擴大酶的應(yīng)用領(lǐng)域，促進生物技術(shù)的發(fā)展。①提高生物活性②增強在不良環(huán)境（非生理條件）中的穩(wěn)定性③針對異體反應(yīng)，降低生物識別能力。 酶化學(xué)修飾的方法 P243 （ 1）酶的表面化學(xué)修飾 ①大分子修飾：可溶性大分子，如 PEG、葡聚糖等通過共價鍵連接（其中分子量 50020200的 PEG 使用最廣）；②小分子修飾：小分子對其活性部位 或側(cè)鏈基團修飾，如氨基葡萄糖等；③交聯(lián)修飾：雙功能試劑如戊二醛等將酶分子之間、亞基之間或分子內(nèi)不同肽鏈部位進行共價交聯(lián)；④固定化修飾：酶共價連接惰性載體 （ 2）酶分子內(nèi)部修飾 ①非催化活性基團修飾：改變酶對特殊底物的束縛能力；②蛋白主鏈修飾；③催化活性基團修飾；④與輔助因子有關(guān)的修飾⑤肽鏈延伸后修飾 （ 3）結(jié)合定點突變的化學(xué)修飾：得到新的酶制劑 修飾酶的特性 ； P244 ⑴熱穩(wěn)定性提高；⑵抗各類失活因子能力提高；⑶抗原性消除；⑷體內(nèi)半衰期延長；⑸最適改變；⑹酶學(xué)性質(zhì)變化： Km 會增大，專一性改變等；⑺對組織 分布能力改變 第六節(jié) 酶工程研究的進展 （有機相酶反應(yīng)、核酶和脫氧核酶、抗體酶） 有機相酶反應(yīng)的定義及其優(yōu)點是什么 ？ P247 （ 1）有機相酶反應(yīng)是指酶在具有有機溶劑存在的介質(zhì)中所進行的催化反應(yīng)。 （ 2）有機相酶反應(yīng)的優(yōu)點：① 增加疏水性底物或產(chǎn)物的溶解度；② 熱力學(xué)平衡向合成方向移動，如酯合成、肽合成等；③ 可抑制有水參與的副反應(yīng)；④ 酶不溶于有機介質(zhì)，易于回收再利用；⑤ 容易從低沸點的溶劑中分離純化產(chǎn)物； ⑥ 酶的熱穩(wěn)定性提高， pH 的適應(yīng)性擴大；⑦ 無微生物污染；⑧ 能測定某些在水介質(zhì)中不能測定的 常數(shù)；⑨ 固定化酶方法簡單，可以只沉淀在載體表面。 有機相酶反應(yīng)的溶劑體系各是什么？如何選擇溶劑體系和有機溶劑的種類？ P248 按照溶劑體系的組成和特點，目前有機相酶反應(yīng)主要有 4 種溶劑體系。 （ 1）水 — 水溶性溶劑均相體系：由水和水溶性有機溶劑相互溶解而形成的均一體系。 （ 2）水 — 水不溶性溶劑兩相體系：有機溶劑在水中的溶解度盡可能小。在該體系中，要求底物在水和有機溶劑中的溶解度盡可能大，而產(chǎn)物在水中的溶解度要小。 （ 3）反相膠團體系：由兩性化合物在占優(yōu)勢的有機相中形成的一系列包圍水滴的體系。 （ 4）單相有機溶劑體系：在該體系中，不存在單獨的水相，只含極微量的水，即在酶分子周圍存在著一層水分子膜，以維持催化反應(yīng)所必需的構(gòu)象。 選擇溶劑體系和有機溶劑的種類要根據(jù)酶的性質(zhì)、底物和產(chǎn)物的溶解度及反應(yīng)器的型式 等具體情況而定。 核酶：（ 1）剪切性核酶：錘頭型核酶、發(fā)夾型、丁型肝炎病毒（ HDV）核酶、蛋白質(zhì) RNA復(fù)合酶（ RNaseP）（ 2）剪接型核酶：Ⅰ內(nèi)含子、Ⅱ內(nèi)含子 ； P250 抗體酶： 一種新型人工酶制劑，是一種具有催化功能的抗體分子，在其可變區(qū)賦予了酶的屬性。它是利用現(xiàn)代生物學(xué)與化學(xué)的理論 與技術(shù)交叉研究的成果，是 抗體的高度選擇性 和酶的高效催化能力 巧妙結(jié)合的產(chǎn)物。 P252 第七章 發(fā)酵工程制藥 第一節(jié) 概述 發(fā)酵工程：微生物工程，利用微生物制造工業(yè)原料與工業(yè)產(chǎn)品并提供服務(wù)的技術(shù)。 P259 發(fā)酵工程發(fā)展 4 個階段： 發(fā)酵工程發(fā)展 4 個階段：（ 1） 20 世紀前，傳統(tǒng)發(fā)酵（酒、醋等）（ 2） 19001940，揭示發(fā)酵本質(zhì) 微生物引起，誕生許多新的發(fā)酵產(chǎn)品（甘油、丙酮等），純培養(yǎng)技術(shù)；（ 3）發(fā)酵大發(fā)展，青霉素工業(yè)推動發(fā)酵，深層培養(yǎng)技術(shù)；主要標志有：抗生素、氨基酸、核酸、甾體的微生物轉(zhuǎn)化（ 4）基因工程應(yīng) 用于發(fā)酵 ； P260 發(fā)酵工程內(nèi)容：菌種培養(yǎng)和選育、菌的代謝與調(diào)節(jié)、培養(yǎng)基滅菌、通氣攪拌、溶氧、發(fā)酵條件優(yōu)化、發(fā)酵過程各種參數(shù)與動力學(xué)、發(fā)酵反應(yīng)器的設(shè)計和自動控制、產(chǎn)品的分離純化和精制等。 P261 發(fā)酵工業(yè)的生產(chǎn)水平取決于三要素： 生產(chǎn)菌種、發(fā)酵工藝、發(fā)酵設(shè)備。 P261 第二節(jié) 優(yōu)良菌種的選育 自然菌種有時不能滿足生產(chǎn)需求，要想得到性能更優(yōu)良的高產(chǎn)菌種，就必須選育突變株。 菌種選育； P261 菌種選育包括：自然選育、誘變育種、雜交育種等經(jīng)驗育種方法，還包括控制雜交育種、原生質(zhì)體融合、基因工程等定向育 種方法。 誘變機制 ； P262 誘變會使生物遺傳物質(zhì) DNA 發(fā)生變化： 轉(zhuǎn)換：嘌呤與嘌呤、嘧啶與嘧啶之間置換 堿基置換（點突變） 微小損傷突變 顛換：嘌呤與嘧啶之間置換，少見 突變 碼組移動突變（移碼突變） : 堿基缺失或增加非 3 地倍數(shù) 染色體畸變 :染色體遺傳物質(zhì)發(fā)生易位、倒位、缺失、重復(fù) 染色體 組突變：染色體數(shù)目改變 誘變劑及其作用方式 P264 （ 1）物理誘變劑 ①機理： 引起生物 DNA 損傷或斷裂，修復(fù)時發(fā)生錯誤拼接與復(fù)制 ②種類：紫外線、 X 射線、γ射線、快中子、激光 （ 2）化學(xué)誘變劑 ① 與堿基發(fā)生反應(yīng)，使 DNA 復(fù)制時使堿基配對錯誤：烷化劑，如 硫酸二乙酯（ DES）、甲基磺酸乙酯（ EMS）、亞硝基胍（ NTG）、氮芥（ NM）等 ②堿基的類似物，摻入到 DNA 中引起變異： 5溴尿嘧啶（ 5BU）是胸腺嘧啶（ T） 的類似物 ③ 移碼突變：吖啶類物質(zhì) （ 3）生物誘變劑：噬菌體（碼組移動） 原生質(zhì)體融 合； P266 原生質(zhì)體融合： 脫壁細胞通過物理、化學(xué)等因子的誘導(dǎo)，兩個 親本 原生質(zhì)體合并在一起形成融合細胞的過程。 過程：（ 1）標記菌株（細胞）：通過誘變使菌株（細胞）具備遺傳標記（如：營養(yǎng)缺陷）以便篩選 （ 2）制備原生質(zhì)體： 將兩親株分別用酶 （ 細菌用溶菌酶，酵母菌和霉菌用蝸牛酶或纖維素酶 ） 處理，使細胞壁全部消化或使 之 破裂，原生質(zhì)體即可從細胞內(nèi)逸出。為了防止原生質(zhì)體的破裂，要把原生質(zhì)體釋放到高滲緩沖液或培養(yǎng)基中。 （ 3） 原生質(zhì)體融合和再生 ： 制備好的二親本原生質(zhì)體可通過化學(xué)因子 （ PEG） 誘導(dǎo)或電場誘導(dǎo)進行融合。兩 個原生質(zhì)體融合后，必須涂布于再生培養(yǎng)基上，使其再生。 （ 4） 融合子的 篩選： 依靠在選擇培養(yǎng)基上的遺傳標記，有二個遺傳標記互補，就可確定其為融合子。 第三節(jié) 發(fā)酵的基本過程（重點） 發(fā)酵的基本過程是怎樣的？ P267 培養(yǎng)基 菌種→種子制備→發(fā)酵→發(fā)酵液預(yù)處理→提取精制 （ 1）菌種：經(jīng)過人工選育的高產(chǎn)優(yōu)良菌種。為防止菌種衰退，需把菌種進行保藏，并且還需不斷純化。 （ 2）種子制備：菌種的擴大化培養(yǎng)。一般 保藏菌種→斜面培養(yǎng)（活化）→搖瓶培養(yǎng)→種子罐培養(yǎng)→發(fā)酵罐，以便得到足 夠數(shù)量和質(zhì)量的純種。 （ 3）發(fā)酵 ① 培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備滅菌 ②接入 5%20%的菌種 ③ 在發(fā)酵罐內(nèi)進行發(fā)酵 ④需對發(fā)酵罐內(nèi)各種條件進行控制以保證發(fā)酵正常進行：溶氧（通氣攪拌）、罐壓、溫度、 PH 、泡沫等 發(fā)酵周期因品種而異 （ 4）產(chǎn)物提取 ①發(fā)酵液的預(yù)處理和過濾；②提取；③精制 第四節(jié) 發(fā)酵方式 發(fā)酵的操作方式和特點 ； P268 （ 1）分批發(fā)酵 ①定義： 營養(yǎng)物和菌種一次加人進行培養(yǎng)，直到結(jié)束放出，與外部沒有物料交換 的培養(yǎng)方式。在這一過程中，除了氧氣、消泡劑及 控制 pH 的酸或堿外，不再加入任何其它物質(zhì)。 ②特點：微生物所處的環(huán)境在發(fā)酵過程中不斷變化，其物理，化學(xué)和生物參數(shù)都隨時間而變化，是一個不穩(wěn)定的過程。 ③ 優(yōu)點：操作簡單；操作引起染菌的概率低；不會產(chǎn)生菌種老化和變異等問題 缺點：非生產(chǎn)時間較長、設(shè)備利用率低。 （ 2）連續(xù)發(fā)酵 ① 定義：培養(yǎng)基料液連續(xù)輸入發(fā)酵罐，并同時放出含有產(chǎn)品的相同體積發(fā)酵液，使發(fā)酵罐內(nèi)料液量維持恒定，微生物在近似恒定狀態(tài)下生長的發(fā)酵方式。 ②特點：發(fā)酵罐內(nèi)料液量維持恒定，微生物在近似恒定狀態(tài) ③優(yōu)點 ：能維持低基質(zhì)濃度；可以提高設(shè)備利用率 和單位時間的產(chǎn)量；便于自動控制。 缺點 ：菌種發(fā)生變異的可能性較大；要求嚴格的無菌條件。 （ 3）補料分批發(fā)酵 ①定義 ：補料分批發(fā)酵又稱半連續(xù)發(fā)酵或流加分批發(fā)酵，是指在分批發(fā)酵過程中，間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基的發(fā)酵方式。 ② 優(yōu)點 ：使發(fā)酵系統(tǒng)中維持很低的基質(zhì)濃度；和連續(xù)發(fā)酵比、不需要嚴格的無菌條件；不會產(chǎn)生菌種老化和變異等問題。 缺點 ：存在一定的非生產(chǎn)時間；和分批發(fā)酵比，中途要流加新鮮培養(yǎng)基，增加了染菌的危險。 第五節(jié) 發(fā)酵工藝控制 影響發(fā)酵的主要因素有哪些？如何對發(fā)酵過程進行控制？ P269 （ 1）培養(yǎng)基 的影響及控制：配制合適成分的培養(yǎng)基（碳源、氮源、無機鹽、微量元素和水），特別是碳氮比要適宜 （ 2）溫度的影響及控制：有最適生長溫度和最適發(fā)酵溫度；通過在發(fā)酵罐夾套或蛇管中流冷、熱介質(zhì)進行控溫。 （ 3） PH 的影響及控制：有最適生長 PH 和最適發(fā)酵 PH；通過加酸性物質(zhì)或堿性物質(zhì)調(diào)節(jié) PH，也可補料來調(diào)節(jié) （ 4）溶氧的影響及控制：根據(jù)微生物對氧的需求來控制溶氧濃度；調(diào)節(jié)通氣速率和攪拌速