【文章內(nèi)容簡介】 。 動物細胞培養(yǎng)的操作方式 ； P106 動物細胞培養(yǎng)的操作方式一般可分為分 批式、加料 — 分批或流加式、半連續(xù)式、連續(xù)式和灌流式。 （ 1）分批式操作 （一種是將細胞和培養(yǎng)基一次性加入反應器內(nèi)進行培養(yǎng)，此后細胞不斷增長，產(chǎn)物不斷形成和積累。最后將條件培養(yǎng)基， 即經(jīng)培養(yǎng)已含有細胞產(chǎn)物的培養(yǎng)基，或連同細胞一并取出，培養(yǎng)結(jié)束。另一種是先將細胞和培養(yǎng)基加入反應器，待細胞生長至一定密度后，往反應器內(nèi)加入誘導劑或病毒等，經(jīng)一段時間作用后，將反應物取出。） （ 2）半連續(xù)式操作 （該方式是當細胞和培養(yǎng)基一起加入反應器后，在細胞增長和產(chǎn)物形成過程中，每間隔一 段時間，取出部分培養(yǎng)物，或單純是條件培養(yǎng)基，或連同細胞、載體一起，然后補充同樣數(shù) 量的新鮮培養(yǎng)基，或另加新鮮載體，繼續(xù)培養(yǎng)。該操作方式在動物細胞培養(yǎng)和藥品生產(chǎn)中被 廣泛采用。） （ 3）灌流式操作 （該方式是當細 胞和培養(yǎng)基一起加入反應器后，在細胞增長和產(chǎn)物形成過程中，不斷地將 部分條件培養(yǎng)基取出，同時不斷地補充新鮮培養(yǎng)基。它與連續(xù)式操作不同處，在于取出部分 條件培養(yǎng)基時，絕大部分細胞仍保留在反應器內(nèi)，而連續(xù)式培養(yǎng)則同時也取出部分細胞。） 括號部分的內(nèi)容重在理解 第七節(jié) 動物細胞 生物反應器 動物細胞生物反應器必需具備的基本要求 ； P107 （ 1）一切材料，對細胞必須無毒性。（ 2）具有良好的傳質(zhì)、傳熱和混合的性能。（ 3）密封性能良好（ 4）對多種物理化學參數(shù)能自動檢測、調(diào)節(jié)和高精度控制（ 5）可長期連續(xù)運轉(zhuǎn) （ 6）容器內(nèi)面光滑，無死角（ 7）拆裝、連接和清潔方便，能耐高壓蒸汽消毒，便于操作維修。設(shè)備成本盡可能低。 動物細胞生物反應器的類型及特點 ； P108 （ 1） 攪拌罐式生物反應器（目前最廣泛應用的動物細胞反應器 ）： 靠攪拌槳提供液相攪拌的動力，它有較大的操作范圍、良好的混合性和濃度均勻性 （ 2）氣升式生物反應器： 其特點是結(jié)構(gòu)簡單，操作方便。 （ 3）固定床式生物反應器：結(jié)構(gòu)簡單、裝填材料無毒且利于細胞貼壁，剪切力小的特點 （ 4）流化床式生物反應器 ：可連續(xù)操作 （ 5）袋式或膜式生物反應器：可取出某些有害代謝物 （ 6）中空纖維生物反應器：用途較廣，既可培養(yǎng)懸浮生長的細胞，又可培養(yǎng)貼壁依賴性細胞，細胞的密度高，如果控制系統(tǒng)不受污染，能長期運轉(zhuǎn)。 反應器及檢測 ； P114 （ 1）溫度檢測元件：電阻溫度計；（ 2） PH：復合式參比電極 （ 3）溶氧：極普電極或電流式覆膜電極 第十 節(jié) 動物細胞制藥的前景與展望 動物細胞制藥有哪些新進展？ P135 （ 1）改進表達載體，提高表達水平和產(chǎn)量：①采用更強的啟動子和增強子②更好的利用擴增系統(tǒng)或?qū)ふ腋弑磉_位點③采用和改造更好的宿主細胞 （ 2）利用代謝工程，改進培養(yǎng)工藝，降低生產(chǎn)成本 ：①采用代謝工程改造工程細胞②改進培養(yǎng)工藝，降低生產(chǎn)成本 （ 3）抑制細胞凋亡，延長培養(yǎng)周期 （ 4） 采用糖基化工程，提高產(chǎn)品質(zhì)量 （ 5）轉(zhuǎn)基因動物的研究 （ 6）組織工程的研究 代謝工程：采用基因工程的手段，使工程細胞增加或減少某種酶，改造它的代謝能力和途徑，使其降低對某些營養(yǎng)物質(zhì)的需求，減少某些代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和無害，以及控制工程細胞的增殖速度和制造產(chǎn)品的能力。 P137 第四章 抗體制藥 第一節(jié) 概述 P143 抗體：即 Ig，指能與相應抗原特異性結(jié)合具有免疫功能的球蛋白。 1975 年 Kohler 和 Milstein 首先利用 B 淋巴細胞雜交瘤技術(shù)制備出單克隆抗體（ McAb）。 單克隆抗體：將抗體產(chǎn)生細胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細胞相融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細胞成為純一的單克隆細胞系而產(chǎn)生的特異性完全相同的高純度抗體。 單克隆抗體有缺陷：分子量過大；鼠源性抗體；所以要改造：降低單克隆抗體的免疫源性和降低其相對分子量。 P144 第二節(jié) 單克隆抗體及其制備 （重點） 克隆化：指單個細胞通過無性繁殖而獲得細胞集團的整個培養(yǎng)過程。 P148 什么是單克隆抗體？它是如何制備的？ P144 （ 1） 抗原與動物免疫 ①制備高純度抗原： 抗原可以用化學合成，如精制地高辛。 多數(shù)抗原物為混合物須經(jīng)免疫、篩選、克隆化。 ②用抗原 免疫脾細胞的制備 ：有體內(nèi)免疫法和體外免疫法 。體內(nèi)免疫就是將抗原注射到小鼠腹腔，使小鼠產(chǎn)生免疫反應， B 細胞迅速增殖；體外免疫小鼠脾細胞的懸浮液與抗原一起培養(yǎng)后，再分離脾細胞。 （ 2） 細胞融合與雜交瘤細胞 的選擇性培養(yǎng) ①骨髓瘤細胞：和免疫動物同源， 目前常用的骨髓瘤細胞系多來自 BALB/c 小鼠（最常用）和 LOU 大鼠。 ②脾細胞和骨髓瘤細胞融合： 脾細胞（ 1 108）和骨髓瘤細胞（ 2 107）混合，在聚乙二醇誘導下融合 2 分鐘，然后用培養(yǎng)液將融合液緩慢稀釋。（常用 PEG 相對分子量 4000，濃度為4050%， 二甲基亞砜增加融合率） ③ 選擇性培養(yǎng) :選擇培養(yǎng)基 為 HAT 培養(yǎng)液。 次黃嘌呤 (H)氨甲喋呤 (A)胸腺嘧啶 (T)配制。其上脾 — 瘤融合細胞可以生長，脾 — 脾、瘤 — 瘤融合細胞死亡。（培養(yǎng)基中需要加入飼養(yǎng)細胞才能繁 殖，常用飼養(yǎng)細胞是小鼠腹腔巨噬細胞、脾細胞、胸腺細胞等） （ 3）篩選陽性克隆與克隆化 ① 篩選陽性克隆常用檢測方法：免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)等。 ②克隆化： 有限稀釋法 （ 將對數(shù)生長期的雜交瘤細胞用培養(yǎng)液作一定的稀釋后，按每孔 1個細胞接種在培養(yǎng)皿中，細胞增值后成為單克隆細胞系。 ）和 軟瓊脂法 （ 將雜交瘤細胞稀釋到一定密度，然后與瓊脂混懸。在瓊脂中的細胞不能自由移動，彼此互不相混，從而達到單細胞培養(yǎng)的目的 ） （ 4）雜交瘤細胞與抗體性狀的鑒定 雜交瘤細胞鑒定：染色體分析。另外還檢測抗體特異性、純度、分子量 等。 （ 5）單克隆抗體的大量制備 ①體外培養(yǎng)法和體內(nèi)誘生法，多采用后者 ②體內(nèi)誘生法：降脂烷注射小鼠腹腔后再接種雜交瘤細胞，取腹水，離心 ，取上清。 （ 6）單克隆抗體的純化 依單抗 IgG 類和亞類不同，選各種不同的純化方法。 體內(nèi)誘生法單克隆抗體的純化方法： ①離心 取上清，超濾，鹽析。 ②分離：凝膠過濾用于 IgG IgM 單抗純化；陰離子交換層析 IgG 單抗純化；親和層析 IgG單抗純化。 ELISA 法 ：酶聯(lián)免疫吸附試驗 ，基本方法是 將已知 的抗原或抗體吸附在固相載體 ( 聚苯乙烯微量反應板 ) 表面，使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。 原理： 酶分子與抗體或抗抗體分子共價結(jié)合，此種結(jié)合不會改變抗體的免疫學特性，也不影響酶的生物學活性。此種酶標記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應。因此，可通過底物的顏色反應來判定有無相應的免疫反應，顏色反應的深淺與標本中相應抗體或抗原的量呈正比 。 P147 第三節(jié) 基因工程 抗體及其制備 （即鼠源性單克隆抗體的改造） 基因工程抗體： 過 PCR 技術(shù)獲得抗體基因或抗體基因片段，與適當載體重組后引入不同表達系統(tǒng)所產(chǎn)生的抗體，被廣泛應用于疾病的臨床臨床診斷、預防、治療及基礎(chǔ)理論研究等領(lǐng)域。 P150 Ig分子結(jié)構(gòu) P150 （ 1） 由 2 條重鏈 (簡稱 H 鏈 )和 2 條輕鏈 （ 簡稱 L 鏈 ） 組成 Y字型結(jié)構(gòu)分子 ，鏈與 鏈之間由一對或一對以上的二硫鍵互相連接 （ 2） Ig 分子氨基酸端 L 鏈 的 1/2 與 H 鏈 的1/4 的氨基酸組成及順序多變，構(gòu)成 可變區(qū)(簡稱 V 區(qū) )， V 區(qū) 中某些特定位置構(gòu)建抗體和抗原特異結(jié)合的 關(guān)鍵部位，稱為互補決定區(qū)（ CDR） 它賦于抗體以特異性 。 （ 3）羧基端 L 鏈 的 1/2 與 H 鏈 的 134 的氨基酸組成及順序較恒定，構(gòu)成 恒定區(qū) (簡稱 C區(qū) )，它決定 Ig 分子的異種抗原性。 （ 4） L 鏈 有 VL 和 CL 連個功能區(qū)， H 鏈 有VH、 CH CH CH3四個功能區(qū)， VL 和 VH 的 CDR 區(qū)共同構(gòu)成一個抗原結(jié)合部位。 基因工程抗體及其特性和制備方法 （ P152 圖 44） （ 1） 人鼠嵌合抗體 ：在基因水平上將鼠源單抗的 H 和 L 鏈可變區(qū)（ V 區(qū)）基因分離出來，分別與人 Ig 的 H 和 L 鏈的穩(wěn)定區(qū)（ C）基因連接成人 鼠嵌合抗體的 H 和 L 鏈基因，再共轉(zhuǎn)染骨髓瘤細胞，就能表達完整人 鼠嵌合抗體。 人 IgC小鼠 IgV （ 2） 改形抗體 （ CDR 移植抗體）：用鼠源單抗的 CDR 序列替換人 Ig 分子中 CDR 序列，則可使人的 Ig 分子具有鼠源單抗的抗原結(jié)合特異性?？上庖咴葱?。 小鼠 CDR 替代人 CDR （ 3） Fab 抗體 ：重鏈 V 區(qū)及 CH1 功能區(qū)與整個輕鏈以二硫鍵形式連接而成，主要發(fā)揮抗體的抗原結(jié)合功能。 Fab 抗體只有完整 IgG 的 1/3。（ Fd：重鏈 V 區(qū)及 CH1功能區(qū)） 完整 L 鏈 +重鏈 V 區(qū) +CH1 功能區(qū) （ 4） Fv 抗體 ：由 VH 和 VL 組成的具有完整抗原結(jié)合位點的最 小抗體片段； VH+VL （ 5） 單鏈抗體：即 scFv，由 VH 和 VL 通過連接肽（接頭）重組并表達而成的一種小分子抗體，其分子量 為整個 Ig分 子的 1/6具有較好的抗原結(jié)合能力，且分子量小、穿透力強、免疫原性低等特性 。 VH多肽 VL （ 6） 單域抗體 ：只有 VH 或 VL 一個功能結(jié)構(gòu)域，也能保持原單克隆抗體的特異性。其分子量僅為整個 Ig 分子的 1/12。 VH或 VL （ 7）最小識別單位：即 MRU，只含有 一個 CDR 多肽的抗體，也為超變區(qū)多肽。 第四節(jié) 多功能抗體及其制備 雙功能抗體： bisFvs，即 雙特異性 單鏈 抗體 ， （天然 Ig 是由兩個完全相同的 VH 和 VL 區(qū)域構(gòu)成，該區(qū)域是特異性識別并結(jié)合抗原的關(guān)鍵部位）經(jīng)人工設(shè)計構(gòu)建的雙特異性抗體由兩個不同的抗原結(jié)合位點組成，可同時與兩種不同的抗原決定簇結(jié)合，并可將其偶連的藥物、酶或放射性核素等導向到靶部位，這種具有雙價雙特異性的抗體又稱為雙功能抗體。 P155 多功能抗體：在 scFv 的基礎(chǔ)上，可以把兩個或兩個以上的 scFv 重組在一起，由此可制備成多價小分子抗體即微型抗體（簡稱多價微抗）。 P157 抗體融合蛋白：抗體的一部分被非抗體序列替代，所形成的融合蛋白具有新的特性，稱之為抗體融合 蛋白。 P158 第五節(jié) 抗體工程 抗體工程 ： 指利用重組 DNA 和蛋白質(zhì)工程技術(shù)，對抗體基因進行加工改造和重新裝配，經(jīng)轉(zhuǎn)染適當?shù)氖荏w細胞后，表達抗體分子，或用細胞融合、化學修飾等方法改造抗體分子的工程。 P159 現(xiàn)在普遍使用噬菌體作為 抗體庫技術(shù)的載體 。 6．噬菌體抗體庫技術(shù)基本方法（過程） P159 噬菌體抗體庫技術(shù)：它是將體外克隆的抗體基因片段插入噬菌體載體，轉(zhuǎn)染工程細菌進行表達，然后用抗原篩選即可獲得特異的單克隆噬菌體抗體。 基本過程： 噬菌體抗體庫技術(shù)基本路線為用RTPCR 方法擴增抗體全套可變區(qū)基因 （ VH+ VL） ，重組到噬菌體載體中 ， 并通過與絲狀噬菌體的外殼蛋白形成融合蛋白 ， 把 Fab 段或 ScFv 表達到噬菌體表面。通過 “ 吸附－洗脫－擴增 ” 的富集過程 ， 從中篩選出特異性抗體的可變區(qū)基因。 （右圖） 第六節(jié) 抗體診斷試劑 一、 三大類抗體診斷藥物 ：血清學鑒定用抗體制劑、免疫標記技術(shù)用抗體制劑、體內(nèi)導向診斷藥物。 P161 二、抗體診斷藥物有哪些類型？ P161 1. 血清學鑒定用的抗體類試劑 （ 1）鑒定病原菌用的抗體試劑 （ 2）乙型肝炎病毒表面抗原（ HBsAg）的反向被動血凝診斷試劑 （ 3）妊娠診斷試劑 （ 4）抗 ABO 血型系統(tǒng)血清 免疫標記技術(shù)用的抗體類試劑 P164 給抗體標記放射性核素、熒光素或酶活性，能將抗原抗體反應放大，使常規(guī)不能觀察的反應得以顯現(xiàn)，可對微量抗原進行定性定量測定，靈敏度提高。結(jié)合顯微鏡技術(shù)，還可對抗原物質(zhì)作出組織內(nèi)或細胞內(nèi)的定位測定。 （ 1）熒光抗體診斷試劑：熒光抗體是用熒光色素 ,如異硫氰酸熒光素（ FITC）、羅丹明（ RB200）、藻紅素（ PE）等標記抗體蛋白，即成熒光抗體。