【文章內(nèi)容簡介】 （ 1）質(zhì)粒（ plasmid）載體 : 質(zhì)粒大小一般 1~300kb ? 克隆的質(zhì)粒載體 ? 允許外源的 DNA 插入，儲存。主要是 DNA 水平上的操作。 ? 基因表達(dá)的質(zhì)粒載體 ? 允許外源 DNA 的插入、儲存和表達(dá)。 作為載體的質(zhì)粒都含有三種共同的組分： 復(fù)制基因 (Ori)、選擇性記號 (Amp,Kana)、多克隆位點 (MCS) （三）目的基因常用制備方法 (重點內(nèi)容 ) —— 較短的基因 100bp 法 —— 可以在體外特異性地擴增目的基因片段 ? 適用于克隆序列清楚的基因 ? 以基因組 DNA 為模板，直接進行 PCR 擴增較難 ? 多采用以 mRNA 為模板的 RTPCR 法 : ? 基因文庫：是指某一特定生物體全部基因組的克隆集合，包括所有外顯子和內(nèi)含子序列。 ? 基因文庫的構(gòu)建：鳥槍法（ shotgun) 文庫法 cDNA ： 為具有與某 RNA 鏈呈互補的堿基序列的單鏈 DNA， 或此 DNA 鏈與具有與之互補的堿基序列的 DNA鏈所形成的 DNA 雙鏈。 cDNA 文庫 ： 指某生物某發(fā)育時期所轉(zhuǎn)錄的全部 mRNA， 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的 cDNA 片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。 (四）載體 DNA 與目的基因的連接 【 連接方法，其各自優(yōu)缺點 】 DNA 分子體外重組： 連接酶催化載體 DNA 與目的基因 DNA 片段連接。形成重組子的過程。 1. 粘性末端的連接： 經(jīng)雙酶切獲得粘性末端，用連接酶進行連接 ：連接效率低，一般采用加尾法、接頭法 ：目的基因與載體 DNA 的摩爾比大于 1 （五）重組 DNA 導(dǎo)入宿主細(xì)胞 ? 宿主細(xì)胞： 原核細(xì)胞：大腸桿菌、枯草桿菌鏈球菌 真核細(xì)胞：酵母、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、植物細(xì)胞 ? 原核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法： 電穿孔轉(zhuǎn)化法 化學(xué)轉(zhuǎn)化法 重組 DNA 導(dǎo)入菌種 特點 導(dǎo)入方法 大腸桿菌 表達(dá)產(chǎn)物的形式：細(xì)胞內(nèi)不溶性表達(dá)（包含體）、胞內(nèi)可溶性表達(dá)、細(xì)胞周質(zhì)表達(dá)，極少還可分泌到胞外表達(dá)。不同的表達(dá)形式具有不同的表達(dá)水平，且會帶來完全不同的雜質(zhì)。 氯化鈣轉(zhuǎn)化法、轉(zhuǎn)染法 哥，只是一個傳說 生物技術(shù)制藥 2020 年五月 11 酵母 ，簡化了分離純化工藝。 電轉(zhuǎn)化法 鏈霉菌 不致病、使用安全，分泌能力強，可將表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，具有糖基化能力，可做理想的受體菌。 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法 哺乳類細(xì)胞 產(chǎn)物是糖基化的，接近或類似于天然產(chǎn)物。但動物細(xì)胞生產(chǎn)慢，生產(chǎn)率低，而且培養(yǎng)條件苛刻，費用高，培養(yǎng)液 濃度較稀。 （八） 重組子的篩選與鑒定 抗生素抗性篩選法 （缺點是假陽性高） 、互補篩選法（藍(lán)白斑篩選）、 營養(yǎng)缺陷型篩選法、噬菌斑篩選法： 菌落 (或噬菌斑 )原位雜交、 DNA 印跡分析、 Northern 印跡 序列測定 （七）原核細(xì)胞表達(dá)的特點及選擇 （重點） 1. 外源基因表達(dá)的調(diào)控元件 啟動子 :是 DNA 鏈上能與 RNA 聚合酶結(jié)合并起始 mRNA 合成的一段序列 i. plac 啟動子 : 最早應(yīng)用于的表達(dá)系統(tǒng)是 Lac 乳糖操縱子 ii. ptrc 啟動子 : 是 trp 啟動子和 lac 啟動子的拼合啟動子 iii. λ PL:λ噬菌體的轉(zhuǎn)錄啟動子 PL,該啟動子受控于λ噬菌體 cI 基因產(chǎn)物 iv. T7 啟動子 : 是當(dāng)今大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的主流 核糖體結(jié)合位點 (rbs): 原核微生物的 mRNA 結(jié)合核糖體的序列稱為 SD 序列 終止子：是基因 3‘端可被 RNA 聚合酶識別并停止轉(zhuǎn)錄功能的特定序列 哥，只是一個傳說 生物技術(shù)制藥 2020 年五月 12 大腸桿菌 表達(dá)可定位于胞內(nèi)、周質(zhì)、胞外 ， 胞內(nèi)表達(dá)率高，但易行成包涵體 表達(dá)形式 特點 圖例 胞內(nèi)表達(dá) 非融合蛋白的胞內(nèi)表達(dá) 表達(dá)非融合蛋白的操縱子必須改建成：細(xì)菌或噬菌體的啟動子 細(xì)菌的 RBS真核基因的 AUG結(jié)構(gòu)基因 *。 易被蛋白酶破壞； N 端有甲硫氨酸，易引起免疫反應(yīng) 融合蛋白的表達(dá) 融合蛋白氨基端是原核序列 ， 羧基端是真核序列；優(yōu)點：操作簡便，蛋白質(zhì)在菌體內(nèi)比較穩(wěn)定 ， 易高效表達(dá)； 分泌型表達(dá) 目標(biāo)蛋白在周質(zhì)空間中表達(dá)，有利于分離純化和減少蛋白水解酶的降解。目標(biāo)蛋白從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到周質(zhì)空間過程中信號肽被加工切除，有效地避免了 N 端附加的甲硫氨酸的產(chǎn)生。 周質(zhì)空間中呈氧化型的氧化還原態(tài)勢使目標(biāo)蛋白能夠較好折疊，維持正確的構(gòu)象。 1) 外源基因密碼子的使用 2) mRNA 的結(jié)構(gòu)： 3) 表達(dá)載體的選擇 4) 外源蛋白的穩(wěn)定性 （八）真核細(xì)胞表達(dá)的特點及選擇 （重點） ? 酵母表達(dá)系統(tǒng) ? 昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) ? 哺乳類細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 1. 酵母表達(dá)系統(tǒng) 巴斯德畢赤酵母 影響外源基因的在酵母中表達(dá)的因素 影響因素 特點 1 外源基因的結(jié)構(gòu) ? mRNA 的 5‘端非翻譯區(qū)（ 5‘UTR）的序列和長度 ? 起始密碼子旁側(cè)序列 ? 富含 A/T 序列導(dǎo)致提前終止 ? 偏愛密碼子 ? 胱氨酸的含量 2 表達(dá)形式及信號肽的選擇 ? 大多選擇分泌表達(dá)： ? 但是信號肽具有選擇性，所以選擇合適 的信號肽對于提高某種重組蛋白質(zhì)的表達(dá)量是非常重要的。 ? 標(biāo)準(zhǔn)的分泌信號肽 OLMF 和 PHO1，但在表達(dá)某些外源基因中失靈 3 啟動子 ? 醇氧化酶 1（ AOX1）基因的啟動子，是目前最強，調(diào)控機理最嚴(yán)格的啟動子之一，用甲醇可嚴(yán)格地調(diào)控外源基因的表達(dá) ? 常見的表達(dá)載體有 pPIC pPIC pHILD pA080 pA081 pPSC3K等，均為整合型載體 哥，只是一個傳說 生物技術(shù)制藥 2020 年五月 13 4 轉(zhuǎn)化子的拷貝數(shù) ? 拷貝數(shù)越高，其產(chǎn)量越高。但存在負(fù)效應(yīng)，會引起細(xì)胞生長量的降低 5 誘導(dǎo)條件 ? 甲醇誘導(dǎo)的時間、濃度、溫度的選擇 6 外源蛋白的降解 ? 選用蛋白酶缺失型宿主菌 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣的昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)通常采用目宿銀紋夜蛾桿狀病毒 (AcNPV)作為表達(dá)載體。 ? 昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點： ? 可表達(dá)較大的外源基因 ? 可表達(dá)不同生物來源的外源基因 ? 與高等生物相似的轉(zhuǎn)錄后加工、修飾 ? 桿狀病毒具有高度宿主專一性 昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，特別是桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)由于其操作安全，表達(dá)量高，目前與酵母表達(dá)系統(tǒng)一樣被廣泛應(yīng)用于基因工程的各個領(lǐng)域中。 由哺乳動物細(xì)胞翻譯后再加工修飾產(chǎn)生的外源蛋白質(zhì)，在活性方面遠(yuǎn)勝于原核表達(dá)系統(tǒng)及酵母、昆蟲細(xì)胞等真核表達(dá)系統(tǒng)，更接近于天然蛋白質(zhì)。 但利用哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白，其產(chǎn)量還不高，難以滿足大規(guī)模的實際應(yīng)用。 ? 將外源基因?qū)氩溉閯游锛?xì)胞的方法 ： ? 感染性病毒顆粒感染宿主細(xì)胞 ? 通過脂質(zhì)體法、顯微注射法、磷酸鈣共沉淀法及 DEAE 一葡聚糖法等非病毒載體的方式將基因?qū)氲郊?xì)胞中。 ? 哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)常用的宿主細(xì)胞 ? CHO、 COS、 BHK、 SP2/0、 NIH3T3 等，不同的宿主細(xì)胞對蛋白表達(dá)水平和蛋白質(zhì)的糖基化有不同的影響，因此在選擇宿主細(xì)胞時應(yīng)根據(jù)具體情況而定。 二、基因重組蛋白的分離純化與分析鑒定 （了解內(nèi)容，略 有空自己 look look書上 P80 唄） 第二節(jié) 基因工程藥物研發(fā)中的特殊要求 （仍然了解內(nèi)容，書上 P 91） 真核細(xì)胞表達(dá)制品的安全性的問題 （居然是掌握 = =） ? 由真核細(xì)胞生產(chǎn)的產(chǎn)品可能存在 ? 與腫瘤相關(guān)的 DNA ? 病毒 DNA 尤其是逆轉(zhuǎn)錄病毒 ? 我國目前規(guī)定：每劑量的藥物所含 DNA 不得大于 100pg。 基因工程藥物穩(wěn)定性研究的相關(guān)問題 ? 影響生物制品的因素： 1. 藥物濃度：蛋白在低濃度下易失活 — 與化學(xué)藥物不同，改變劑型時要重新鑒定其穩(wěn)定性 2. 溫度：升溫加速實驗不適合于生物制品 3. 濕度：應(yīng)低于 13％ 4. 氧：應(yīng)測定在有氧環(huán)境中的穩(wěn)定性，采用密封包裝 5. 光照：應(yīng)測定光解作用的影響，采用遮光包裝 6. pH：應(yīng)測定 pH 的影響 第四章 動物細(xì)胞工程制藥 第一節(jié) 概述 ? 動物細(xì)胞工程制藥所涉及的主要技術(shù)領(lǐng)域包括細(xì)胞融合技術(shù)、細(xì)胞核移植技術(shù)、動物細(xì)胞反應(yīng)器，哥，只是一個傳說 生物技術(shù)制藥 2020 年五月 14 動物克隆，染色體改造，基因轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)和細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)等方面；最基本的有 細(xì)胞融合技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)和細(xì)胞大規(guī)模 培養(yǎng)技術(shù)三項技術(shù) 動物細(xì)胞的培養(yǎng)特征（了解） ，無細(xì)胞壁，抗機械強度低，對剪切力敏感，適應(yīng)環(huán)境能力差。 ，生長 緩慢，易污染，培養(yǎng)時添加抗生素 ，有些需 CO2 。 動物細(xì)胞的分類； 1. 貼壁依賴性細(xì)胞 :包括成纖維細(xì)胞型，上皮細(xì)胞型。生長于支持物表面。 2. 非貼壁依賴性 /懸浮細(xì)胞 ：這類細(xì)胞培養(yǎng)時不貼附于支持物上，可在培養(yǎng)液中懸浮生長。來源于血液、淋巴組織，許多腫瘤細(xì)胞等均屬于此類。細(xì)胞一般呈圓形。 有些細(xì)胞呈現(xiàn)雙重性，既可以貼壁生長，也可以懸浮培養(yǎng)。如中國倉鼠卵巢細(xì)胞，小鼠 L929 細(xì)胞 ， CHO細(xì)胞 第二節(jié) 生產(chǎn)用動物細(xì)胞 一、生產(chǎn)用動物細(xì)胞的獲得 （一）非基因工程細(xì)胞的獲得 原代細(xì)胞 傳代細(xì)胞系 轉(zhuǎn)化細(xì)胞系 定義 直接取自動物組織、器官，經(jīng)過粉碎、消化而獲得的細(xì)胞懸液 原代細(xì)胞經(jīng)過傳代、篩選、克隆，從多種細(xì)胞成分的組織中挑選并純化出某種具有一定特征的細(xì)胞株 通過某個轉(zhuǎn)化過程形成的，失去正常細(xì)胞的特點。由于染色體的斷裂變成異倍體，獲得無限增殖的能力得到的細(xì)胞 特點 增殖能力有限，需要大量的動物才能增加產(chǎn)量，費錢費勞力 , 限制了它的應(yīng)用。 動物細(xì)胞生產(chǎn)生物藥品的早期，一般用原代培養(yǎng)的細(xì)胞來生產(chǎn)疫苗，如雞胚細(xì)胞、原代兔腎細(xì)胞、鼠腎細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等 適合藥物檢測 染色體組型是 2n 的核型 ,二倍體細(xì)胞系 具有貼壁依賴和接觸抑制的特性 有限的增殖能力， 50 代 無致瘤性 一般從胚胎中獲得，有限傳代 自發(fā)的：正常細(xì)胞中自發(fā)的轉(zhuǎn)化形成有無限生命力的細(xì)胞系；多發(fā)生于嚙齒類細(xì)胞動物 人為轉(zhuǎn)化：采用某些病毒 SV40 或某些化學(xué)試劑 從動物腫瘤組織中建立的細(xì)胞系 轉(zhuǎn)化細(xì)胞為永生化細(xì)胞，無限細(xì)胞系，連續(xù)細(xì)胞系。 轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有無限生命力，倍增時間短，對培養(yǎng)條件和生長因子等要求低，更適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn) （二）基因工程細(xì)胞系的構(gòu)建 【大體構(gòu)建流程】 基因工程細(xì)胞系：用基因工程技術(shù)或細(xì)胞融合技術(shù)對宿主細(xì)胞的遺傳物質(zhì)進行修飾改造或重組，獲得具有穩(wěn)定遺傳的獨特性狀的細(xì)胞系 ， 分雜種細(xì)胞和重組細(xì)胞 基因工程細(xì)雜種細(xì)胞 細(xì)胞融合 （仙臺病毒、聚乙二醇 50%、物理方法：電擊法，激光法） → 雜種細(xì)胞篩選 細(xì)胞融合后，除目的雜種細(xì)胞外，還有同合體細(xì)胞和未融合的親本細(xì)胞 篩選方法：（ 1）營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞系或抗性細(xì)胞系作為融合的親本細(xì)胞，選擇培養(yǎng)基來篩選 （ 2）利用或人為制造兩個親本細(xì)胞的物理差異，如大小，密度等進行篩選 （ 3）利用或人為制造雜種細(xì)胞與未融合細(xì)胞生化或分生能力的差異，進行篩選。 哥，只是一個傳說 生物技術(shù)制藥 2020 年五月 15 胞系的構(gòu)建 重組細(xì)胞 包括 CHO， BHK21,SP2/0， Vero 細(xì)胞等 ， 最多用的是 CHO 細(xì)胞 表達(dá)載體的構(gòu)建 （外源基因在動物細(xì)胞中高效表達(dá)，首先要將其構(gòu)建在高效表達(dá)載體內(nèi)，表達(dá)載體兩類： ，牛痘病毒、腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒和桿狀病毒 b. 質(zhì)粒載體 —— 穿梭質(zhì)粒載體 (選擇性標(biāo)記 +增加拷貝數(shù)基因 )） → 基因載體的導(dǎo)入 → 高效表達(dá)工程細(xì)胞株的篩選 (Neor: G418。tk+：胸腺嘧啶激酶 hgprt+：次黃嘌呤 ) 牛痘病毒感染細(xì)菌 (牛痘啟動子 amp。重組基因 )— 轉(zhuǎn)化 — 培養(yǎng) — 收集 桿狀病毒首先和質(zhì)粒一起在細(xì)胞中培養(yǎng)；質(zhì)?！案腥尽辈《?得到的重組病毒再去轉(zhuǎn)染其他細(xì)胞 (重組 DNA 病毒介導(dǎo)法 ) 附： PEG： 主要用于生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的制備 二、制藥工業(yè)中常用的動物細(xì)胞（詳見課本 118 表 43） 細(xì)胞名稱 來源 特性 培養(yǎng)條件 用途 W138 正常肺組織，成纖維細(xì)胞 2N BME+10%小牛血清 制備疫苗 Vero 非洲綠猴腎臟，貼壁成 2N=60 199+5%胎牛血清 增殖病毒，產(chǎn)疫苗，