【文章內容簡介】 （ 1）質粒（ plasmid）載體 : 質粒大小一般 1~300kb ? 克隆的質粒載體 ? 允許外源的 DNA 插入，儲存。主要是 DNA 水平上的操作。 ? 基因表達的質粒載體 ? 允許外源 DNA 的插入、儲存和表達。 作為載體的質粒都含有三種共同的組分： 復制基因 (Ori)、選擇性記號 (Amp,Kana)、多克隆位點 (MCS) （三）目的基因常用制備方法 (重點內容 ) —— 較短的基因 100bp 法 —— 可以在體外特異性地擴增目的基因片段 ? 適用于克隆序列清楚的基因 ? 以基因組 DNA 為模板，直接進行 PCR 擴增較難 ? 多采用以 mRNA 為模板的 RTPCR 法 : ? 基因文庫：是指某一特定生物體全部基因組的克隆集合，包括所有外顯子和內含子序列。 ? 基因文庫的構建：鳥槍法（ shotgun) 文庫法 cDNA ： 為具有與某 RNA 鏈呈互補的堿基序列的單鏈 DNA， 或此 DNA 鏈與具有與之互補的堿基序列的 DNA鏈所形成的 DNA 雙鏈。 cDNA 文庫 ： 指某生物某發(fā)育時期所轉錄的全部 mRNA， 經反轉錄形成的 cDNA 片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。 (四）載體 DNA 與目的基因的連接 【 連接方法，其各自優(yōu)缺點 】 DNA 分子體外重組： 連接酶催化載體 DNA 與目的基因 DNA 片段連接。形成重組子的過程。 1. 粘性末端的連接： 經雙酶切獲得粘性末端，用連接酶進行連接 ：連接效率低，一般采用加尾法、接頭法 ：目的基因與載體 DNA 的摩爾比大于 1 （五）重組 DNA 導入宿主細胞 ? 宿主細胞： 原核細胞：大腸桿菌、枯草桿菌鏈球菌 真核細胞：酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞、植物細胞 ? 原核細胞的轉化方法： 電穿孔轉化法 化學轉化法 重組 DNA 導入菌種 特點 導入方法 大腸桿菌 表達產物的形式：細胞內不溶性表達（包含體）、胞內可溶性表達、細胞周質表達，極少還可分泌到胞外表達。不同的表達形式具有不同的表達水平，且會帶來完全不同的雜質。 氯化鈣轉化法、轉染法 哥，只是一個傳說 生物技術制藥 2020 年五月 11 酵母 ，簡化了分離純化工藝。 電轉化法 鏈霉菌 不致病、使用安全，分泌能力強，可將表達產物直接分泌到培養(yǎng)液中，具有糖基化能力，可做理想的受體菌。 原生質體轉化法 哺乳類細胞 產物是糖基化的，接近或類似于天然產物。但動物細胞生產慢，生產率低，而且培養(yǎng)條件苛刻，費用高，培養(yǎng)液 濃度較稀。 （八） 重組子的篩選與鑒定 抗生素抗性篩選法 （缺點是假陽性高） 、互補篩選法（藍白斑篩選）、 營養(yǎng)缺陷型篩選法、噬菌斑篩選法： 菌落 (或噬菌斑 )原位雜交、 DNA 印跡分析、 Northern 印跡 序列測定 （七）原核細胞表達的特點及選擇 （重點） 1. 外源基因表達的調控元件 啟動子 :是 DNA 鏈上能與 RNA 聚合酶結合并起始 mRNA 合成的一段序列 i. plac 啟動子 : 最早應用于的表達系統(tǒng)是 Lac 乳糖操縱子 ii. ptrc 啟動子 : 是 trp 啟動子和 lac 啟動子的拼合啟動子 iii. λ PL:λ噬菌體的轉錄啟動子 PL,該啟動子受控于λ噬菌體 cI 基因產物 iv. T7 啟動子 : 是當今大腸桿菌表達系統(tǒng)的主流 核糖體結合位點 (rbs): 原核微生物的 mRNA 結合核糖體的序列稱為 SD 序列 終止子：是基因 3‘端可被 RNA 聚合酶識別并停止轉錄功能的特定序列 哥，只是一個傳說 生物技術制藥 2020 年五月 12 大腸桿菌 表達可定位于胞內、周質、胞外 ， 胞內表達率高，但易行成包涵體 表達形式 特點 圖例 胞內表達 非融合蛋白的胞內表達 表達非融合蛋白的操縱子必須改建成：細菌或噬菌體的啟動子 細菌的 RBS真核基因的 AUG結構基因 *。 易被蛋白酶破壞； N 端有甲硫氨酸，易引起免疫反應 融合蛋白的表達 融合蛋白氨基端是原核序列 ， 羧基端是真核序列；優(yōu)點：操作簡便，蛋白質在菌體內比較穩(wěn)定 ， 易高效表達； 分泌型表達 目標蛋白在周質空間中表達，有利于分離純化和減少蛋白水解酶的降解。目標蛋白從細胞質轉運到周質空間過程中信號肽被加工切除，有效地避免了 N 端附加的甲硫氨酸的產生。 周質空間中呈氧化型的氧化還原態(tài)勢使目標蛋白能夠較好折疊，維持正確的構象。 1) 外源基因密碼子的使用 2) mRNA 的結構： 3) 表達載體的選擇 4) 外源蛋白的穩(wěn)定性 （八）真核細胞表達的特點及選擇 （重點） ? 酵母表達系統(tǒng) ? 昆蟲細胞表達系統(tǒng) ? 哺乳類細胞表達系統(tǒng) 1. 酵母表達系統(tǒng) 巴斯德畢赤酵母 影響外源基因的在酵母中表達的因素 影響因素 特點 1 外源基因的結構 ? mRNA 的 5‘端非翻譯區(qū)（ 5‘UTR）的序列和長度 ? 起始密碼子旁側序列 ? 富含 A/T 序列導致提前終止 ? 偏愛密碼子 ? 胱氨酸的含量 2 表達形式及信號肽的選擇 ? 大多選擇分泌表達： ? 但是信號肽具有選擇性，所以選擇合適 的信號肽對于提高某種重組蛋白質的表達量是非常重要的。 ? 標準的分泌信號肽 OLMF 和 PHO1，但在表達某些外源基因中失靈 3 啟動子 ? 醇氧化酶 1（ AOX1）基因的啟動子，是目前最強，調控機理最嚴格的啟動子之一，用甲醇可嚴格地調控外源基因的表達 ? 常見的表達載體有 pPIC pPIC pHILD pA080 pA081 pPSC3K等，均為整合型載體 哥，只是一個傳說 生物技術制藥 2020 年五月 13 4 轉化子的拷貝數 ? 拷貝數越高，其產量越高。但存在負效應，會引起細胞生長量的降低 5 誘導條件 ? 甲醇誘導的時間、濃度、溫度的選擇 6 外源蛋白的降解 ? 選用蛋白酶缺失型宿主菌 桿狀病毒表達系統(tǒng)是目前應用最廣的昆蟲細胞表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)通常采用目宿銀紋夜蛾桿狀病毒 (AcNPV)作為表達載體。 ? 昆蟲細胞表達系統(tǒng)的優(yōu)點： ? 可表達較大的外源基因 ? 可表達不同生物來源的外源基因 ? 與高等生物相似的轉錄后加工、修飾 ? 桿狀病毒具有高度宿主專一性 昆蟲細胞表達系統(tǒng)，特別是桿狀病毒表達系統(tǒng)由于其操作安全，表達量高，目前與酵母表達系統(tǒng)一樣被廣泛應用于基因工程的各個領域中。 由哺乳動物細胞翻譯后再加工修飾產生的外源蛋白質，在活性方面遠勝于原核表達系統(tǒng)及酵母、昆蟲細胞等真核表達系統(tǒng)，更接近于天然蛋白質。 但利用哺乳動物細胞表達系統(tǒng)表達外源蛋白，其產量還不高，難以滿足大規(guī)模的實際應用。 ? 將外源基因導入哺乳動物細胞的方法 ： ? 感染性病毒顆粒感染宿主細胞 ? 通過脂質體法、顯微注射法、磷酸鈣共沉淀法及 DEAE 一葡聚糖法等非病毒載體的方式將基因導入到細胞中。 ? 哺乳動物細胞表達系統(tǒng)常用的宿主細胞 ? CHO、 COS、 BHK、 SP2/0、 NIH3T3 等，不同的宿主細胞對蛋白表達水平和蛋白質的糖基化有不同的影響，因此在選擇宿主細胞時應根據具體情況而定。 二、基因重組蛋白的分離純化與分析鑒定 （了解內容，略 有空自己 look look書上 P80 唄） 第二節(jié) 基因工程藥物研發(fā)中的特殊要求 （仍然了解內容，書上 P 91） 真核細胞表達制品的安全性的問題 （居然是掌握 = =） ? 由真核細胞生產的產品可能存在 ? 與腫瘤相關的 DNA ? 病毒 DNA 尤其是逆轉錄病毒 ? 我國目前規(guī)定：每劑量的藥物所含 DNA 不得大于 100pg。 基因工程藥物穩(wěn)定性研究的相關問題 ? 影響生物制品的因素： 1. 藥物濃度：蛋白在低濃度下易失活 — 與化學藥物不同，改變劑型時要重新鑒定其穩(wěn)定性 2. 溫度：升溫加速實驗不適合于生物制品 3. 濕度：應低于 13％ 4. 氧：應測定在有氧環(huán)境中的穩(wěn)定性，采用密封包裝 5. 光照：應測定光解作用的影響，采用遮光包裝 6. pH：應測定 pH 的影響 第四章 動物細胞工程制藥 第一節(jié) 概述 ? 動物細胞工程制藥所涉及的主要技術領域包括細胞融合技術、細胞核移植技術、動物細胞反應器，哥，只是一個傳說 生物技術制藥 2020 年五月 14 動物克隆，染色體改造，基因轉移，轉基因動物技術和細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術等方面；最基本的有 細胞融合技術、轉基因動物技術和細胞大規(guī)模 培養(yǎng)技術三項技術 動物細胞的培養(yǎng)特征（了解） ，無細胞壁，抗機械強度低，對剪切力敏感，適應環(huán)境能力差。 ，生長 緩慢，易污染，培養(yǎng)時添加抗生素 ，有些需 CO2 。 動物細胞的分類； 1. 貼壁依賴性細胞 :包括成纖維細胞型，上皮細胞型。生長于支持物表面。 2. 非貼壁依賴性 /懸浮細胞 ：這類細胞培養(yǎng)時不貼附于支持物上，可在培養(yǎng)液中懸浮生長。來源于血液、淋巴組織，許多腫瘤細胞等均屬于此類。細胞一般呈圓形。 有些細胞呈現雙重性，既可以貼壁生長，也可以懸浮培養(yǎng)。如中國倉鼠卵巢細胞，小鼠 L929 細胞 ， CHO細胞 第二節(jié) 生產用動物細胞 一、生產用動物細胞的獲得 （一）非基因工程細胞的獲得 原代細胞 傳代細胞系 轉化細胞系 定義 直接取自動物組織、器官，經過粉碎、消化而獲得的細胞懸液 原代細胞經過傳代、篩選、克隆，從多種細胞成分的組織中挑選并純化出某種具有一定特征的細胞株 通過某個轉化過程形成的，失去正常細胞的特點。由于染色體的斷裂變成異倍體，獲得無限增殖的能力得到的細胞 特點 增殖能力有限，需要大量的動物才能增加產量，費錢費勞力 , 限制了它的應用。 動物細胞生產生物藥品的早期，一般用原代培養(yǎng)的細胞來生產疫苗，如雞胚細胞、原代兔腎細胞、鼠腎細胞、淋巴細胞等 適合藥物檢測 染色體組型是 2n 的核型 ,二倍體細胞系 具有貼壁依賴和接觸抑制的特性 有限的增殖能力， 50 代 無致瘤性 一般從胚胎中獲得，有限傳代 自發(fā)的：正常細胞中自發(fā)的轉化形成有無限生命力的細胞系；多發(fā)生于嚙齒類細胞動物 人為轉化：采用某些病毒 SV40 或某些化學試劑 從動物腫瘤組織中建立的細胞系 轉化細胞為永生化細胞，無限細胞系，連續(xù)細胞系。 轉化細胞具有無限生命力，倍增時間短，對培養(yǎng)條件和生長因子等要求低，更適于大規(guī)模工業(yè)化生產 （二）基因工程細胞系的構建 【大體構建流程】 基因工程細胞系：用基因工程技術或細胞融合技術對宿主細胞的遺傳物質進行修飾改造或重組，獲得具有穩(wěn)定遺傳的獨特性狀的細胞系 ， 分雜種細胞和重組細胞 基因工程細雜種細胞 細胞融合 （仙臺病毒、聚乙二醇 50%、物理方法：電擊法，激光法） → 雜種細胞篩選 細胞融合后，除目的雜種細胞外，還有同合體細胞和未融合的親本細胞 篩選方法：（ 1）營養(yǎng)缺陷型細胞系或抗性細胞系作為融合的親本細胞，選擇培養(yǎng)基來篩選 （ 2）利用或人為制造兩個親本細胞的物理差異，如大小，密度等進行篩選 （ 3）利用或人為制造雜種細胞與未融合細胞生化或分生能力的差異，進行篩選。 哥，只是一個傳說 生物技術制藥 2020 年五月 15 胞系的構建 重組細胞 包括 CHO， BHK21,SP2/0， Vero 細胞等 ， 最多用的是 CHO 細胞 表達載體的構建 （外源基因在動物細胞中高效表達，首先要將其構建在高效表達載體內，表達載體兩類： ，牛痘病毒、腺病毒、反轉錄病毒和桿狀病毒 b. 質粒載體 —— 穿梭質粒載體 (選擇性標記 +增加拷貝數基因 )） → 基因載體的導入 → 高效表達工程細胞株的篩選 (Neor: G418。tk+：胸腺嘧啶激酶 hgprt+：次黃嘌呤 ) 牛痘病毒感染細菌 (牛痘啟動子 amp。重組基因 )— 轉化 — 培養(yǎng) — 收集 桿狀病毒首先和質粒一起在細胞中培養(yǎng)；質粒“感染”病毒 得到的重組病毒再去轉染其他細胞 (重組 DNA 病毒介導法 ) 附： PEG： 主要用于生產單克隆抗體的雜交瘤細胞的制備 二、制藥工業(yè)中常用的動物細胞（詳見課本 118 表 43） 細胞名稱 來源 特性 培養(yǎng)條件 用途 W138 正常肺組織，成纖維細胞 2N BME+10%小牛血清 制備疫苗 Vero 非洲綠猴腎臟，貼壁成 2N=60 199+5%胎牛血清 增殖病毒，產疫苗，