【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 ，從而對(duì)后繼的亞克隆及其他操作造成麻煩。 C. DNA 接頭連接法 ：優(yōu)點(diǎn)： 一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。 當(dāng)它的平末端與平末端的外源 DNA 片段連接后，便會(huì)使后者成為具有粘性末端的 新的 DNA 分子，而易于連接重組； 缺點(diǎn) ：各個(gè) DNA 接頭分子的粘性末端之間，會(huì)通過互補(bǔ)堿基間的配對(duì)作用，形成如同 DNA 銜接物一樣的二聚體分子，失去接頭的本來意義。 （ 克服的方法是將 5?末端的磷酸修飾移去，其結(jié)果為暴露出的 5‘OH所取代。如此一來，雖然兩個(gè)接頭分子粘性末端之間仍具有互補(bǔ)堿基配對(duì)的能力，但終因DNA連接酶無法在 5?OH和 3‘ –OH之間形成磷酸二酯鍵而不會(huì)產(chǎn)生出穩(wěn)定的二聚體分子。 ） ？ ① 分離純化需改造的目的蛋白； ② 了解其一級(jí)結(jié)構(gòu)及高級(jí)結(jié)構(gòu)，了解其結(jié)構(gòu) 功能關(guān)系； ③獲 取編碼該蛋白的基因序列； ④ 設(shè)計(jì)改造方案； ⑤ 對(duì)基因序列進(jìn)行改造； ⑥ 將經(jīng)過改造的基因序列重組入表達(dá)載體，進(jìn)行表達(dá)；⑦分離純化表達(dá)產(chǎn)物，并對(duì)其功能進(jìn)行檢測(cè)。 補(bǔ)充： 1． 限制酶： 凡能識(shí)別并切割雙螺旋 DNA 分子內(nèi)特定核苷酸順序的酶統(tǒng)稱為限制酶。 2． 基因工程新技術(shù) ：蛋白質(zhì)工程，反義藥物， RNAi 技術(shù)，新生物技術(shù)疫苗。 ：①目的抗原基因的選擇和獲得（構(gòu)建 cDNA 文庫(kù)， PCR 擴(kuò)增，人工合成）；②選擇合適的表達(dá)載體；③對(duì)在表達(dá)載體上的基因序列進(jìn)行測(cè)定。 ：① 隨機(jī)酶切成較大的 DNA 片段（ 10~30Kb，平均 20Kb)，對(duì)這些片段進(jìn)行分離； ② 重組入適當(dāng)載體（噬菌體）； ③ 轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主菌（ )，擴(kuò)增，構(gòu)建成基因文庫(kù)；④ 從基因組文庫(kù)中篩選出含有目的基因組的重組子。 技術(shù)： 是指在四種脫氧核苷三磷酸（ dNTP）存在下，以寡聚核苷酸為引物，以單鏈DNA 為模板，經(jīng) DNA 聚合酶催化，合成 DNA 互補(bǔ)鏈達(dá)到基因擴(kuò)增目的的過程。 PCR 反應(yīng)的必要條件 ：須知基因兩端的部分序列 PCR 反應(yīng)中的幾個(gè)關(guān)鍵因素 ： Taq DNA 聚合酶 ； 引物的長(zhǎng)度 ； 模板 。 ： 是人工構(gòu)建的，含有λ DNA 的粘性 (cos)末端序列、質(zhì)粒復(fù)制起始區(qū)及質(zhì)粒一個(gè)抗藥性標(biāo)記的、兼具質(zhì)粒與λ噬菌體 DNA 載體雙重性質(zhì)的特殊載體。 生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 9 酶工程 一、 專業(yè)符號(hào)及名詞解釋 1. NADPH 還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 2. DEAE 二乙氨乙基葡聚糖 3. DNP 二硝基苯酚 4. error prone PCR 易錯(cuò) PCR 5. DNA shuffling DNA 改組 6. IU 酶活力國(guó)際單位 7. Katal 酶活力單位 8. 酶工程 指通過化學(xué)方法、酶學(xué)方法和 DNA 重組技術(shù)改善自然酶的組成、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，以提高酶的催化效率、降低成本并在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中進(jìn)行應(yīng)用的技術(shù) 9. 酶的活力單位 酶在最適條件下，單位時(shí)間內(nèi)，酶催化底物的減少量或產(chǎn)物的生成量 （ IU：指在特定條件下， 1min 內(nèi)生成 1μ mol 產(chǎn)物的酶量） 每毫克酶蛋白所含的酶活力單位數(shù) 酶的比活力 =酶活力單位數(shù) /毫克酶蛋白 （ Immobilized enzyme） 通過物理和化學(xué)的方法將酶束縛在一定空間內(nèi)且仍具有催化活性的酶 制劑 （ Immobilized cell） 指被限制或定位于特定空間位置的細(xì)胞，與固定化酶一起統(tǒng)稱為固定化生物催化劑。 固定化酶活力下降為原初活力一半時(shí)所經(jīng)歷的連續(xù)操作時(shí)間稱為其操作半衰期，其長(zhǎng)短顯示出固定化酶操作穩(wěn)定性的高低 固定化反應(yīng)過程中 載體結(jié)合蛋白質(zhì)的能力稱為偶聯(lián)效率 偶聯(lián)效率（ %） =（加入的總酶蛋白量－上清液殘留總蛋白量） /加入的總酶蛋白量 100% 偶聯(lián)效率（ %） =（加入的總酶活力－上清液殘留總酶活力） /加入的總活力 100% 收率 偶聯(lián)反應(yīng)后，固定化酶所顯示的活力與加入偶聯(lián)液中酶的總活力的比值 活力回收率（ %） =固定化酶總活力 /加入偶聯(lián)液總酶活力 100% 已被固定化的酶的活力與同樣蛋白質(zhì)量的天然酶活力的比值 相對(duì)活力（ %） =固定化酶總活力 /（加入酶總活力－上清液中未偶聯(lián)酶總活力） 100% 以酶（游離酶或固定化酶）作為催化劑進(jìn)行酶促反應(yīng)所需的設(shè)備 在分子水平上對(duì)酶進(jìn)行改造，即在體外將酶的側(cè)鏈基團(tuán)通過人工方法與一些化學(xué)基團(tuán)，特別是具有生物相容性的大分子進(jìn)行共價(jià)連接，從而改變酶的酶學(xué) 性質(zhì)的技術(shù)。 以固定化的 生物成分（如酶、蛋白質(zhì)、 DNA、抗體、抗原）或微生物體本身（如細(xì)胞、微生物、組織等）為敏感材料，與適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)換能器相結(jié)合，用于快速檢測(cè)物理、化學(xué)、生物量的新型器件 生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 10 酶在非水相（也稱為非水介質(zhì)）中也具有催化活性，可以在含有多種有機(jī)溶劑和微量水分的非水介質(zhì)中發(fā)揮催化作用 抗體酶又稱催化抗體（ catalytic antibody），是一類具有抗體的高度特異性又具有酶的高效催化活性的蛋白質(zhì)分子 能在極端環(huán)境中生長(zhǎng)的微生物 叫做極端微生物。極端環(huán)境指普通微生物不能生存的環(huán)境，如高溫、低溫、低 PH、高 PH、高鹽、高輻射、含抗代謝物、有機(jī)溶劑、低營(yíng)養(yǎng)、重金屬及有毒有害物等環(huán)境條件 二、 填空題 酶分子的 主鏈修 飾 、 酶分子的 側(cè)鏈基團(tuán)修飾 、 酶分子的 化學(xué)交 聯(lián)修飾 、 酶分子的 大 分子修飾 、 酶分子的 親 和標(biāo)記修飾 、 酶分子的 基 因修飾 和 與輔助因子相關(guān)的修飾 。 誘導(dǎo)法 、 引入法 、 拷貝法 和 抗體庫(kù)法 。 年國(guó)際生物化學(xué)聯(lián)合會(huì)酶學(xué)委員會(huì)根據(jù)反映類型 ，將酶類分為 氧化 還原酶 、 轉(zhuǎn)移酶 、 水解酶 、 裂合酶 、 異構(gòu)酶 、和 連接酶 。 三、 問答題 ？什么是酶工程？ 酶具有以下特性： 酶是蛋白質(zhì)； 酶的催化效率非常高 ； 酶具有高度的專一性； 酶的反應(yīng)條件溫和（常溫、常壓） ； 酶的催化活性受到調(diào)節(jié)和控制。 酶工程 ：指通過化學(xué)方法、酶學(xué)方法和 DNA 重組技術(shù)改善自然酶的組成、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，以提高酶的催化效率、降低成本并在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中進(jìn)行應(yīng)用的技術(shù) ，試對(duì)各種方法進(jìn)行綜合比較 ？ ① 吸附法 ： 分為物理吸附法及離子交換劑吸附法。 優(yōu)點(diǎn)： 操作簡(jiǎn)單，可選用帶不同電荷和不同形狀的載體，固定化過程可以與純化過程同時(shí)實(shí)現(xiàn)，酶失活后載體仍可再生。 缺點(diǎn)： 最適吸附酶量無規(guī)律遵循，對(duì)不同載體和不同酶的吸附條件不同，吸附量與酶活力不一定呈平行關(guān)系。酶與載體之間結(jié)合力不強(qiáng)，酶易于脫落，導(dǎo)致酶活力下降并污染產(chǎn)物。 ② 共價(jià)結(jié)合法 ： 酶分子的活性基團(tuán)與載體表面活潑基團(tuán)之間經(jīng)化學(xué)反應(yīng)形成共價(jià)鍵的連接法 常用基團(tuán)： 氨基、羧基、酚基及咪唑基等 優(yōu)點(diǎn)： 酶與載體結(jié)合牢固，操作穩(wěn)定性良好。 缺點(diǎn)： 載體需活化，固定化操作復(fù)雜，反應(yīng) 條件較劇烈，酶易失活并產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)。 ③ 交聯(lián)法 ： 采用雙功能或多功能試劑使酶分子內(nèi)或分子間彼此連接成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)而使酶固定化的技術(shù)。 本法又分為（ 1）交聯(lián)酶法、（ 2）酶與輔助蛋白交聯(lián)法、（ 3）吸附交聯(lián)法、（ 4）載體交聯(lián)法 ④ 包埋法 ： 分為凝膠包埋法及微囊化包埋法兩類 優(yōu)點(diǎn)： 制備固定化酶的操作條件溫和，不改變酶的結(jié)構(gòu)，操作時(shí)保護(hù)劑及穩(wěn)定劑均不影響酶的包埋率，適用于多種酶、粗酶制劑、細(xì)胞器及細(xì)胞的固定化。 缺點(diǎn)： 固定化酶只適用于小分子底物及小分子產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，不適用于催化大分子底物或產(chǎn)物的反應(yīng)。由于擴(kuò)散阻力將導(dǎo)致 酶動(dòng)力學(xué)行為改變而降低活力 生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 11 ？ 殘留法、水解法 ？ 構(gòu)象效應(yīng)、屏蔽效應(yīng)（或稱位阻效應(yīng)）、微環(huán)境效應(yīng)（或稱分配效應(yīng)）、擴(kuò)散效應(yīng) ？ 分批測(cè)定法、連續(xù)測(cè)定法 ，固定化酶具有哪些優(yōu)點(diǎn)？ （ 1）穩(wěn)定性較天然酶高 （ 2）反應(yīng)后，酶與底物易于分開，并可長(zhǎng)期反復(fù)使用 （ 3）反應(yīng)液中無殘留酶，產(chǎn)物易于純化，產(chǎn)品質(zhì)量高 （ 4）可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化反應(yīng)連續(xù)化和自動(dòng)化控制； （ 5）酶的利用效率高，產(chǎn)品成本低。 （ 6）轉(zhuǎn)化反 應(yīng)基本無三廢排出，因此稱之為 ―無公害酶 ‖ ，固定化細(xì)胞具有哪些優(yōu)點(diǎn)？ （ 1）無需進(jìn)行酶的分離純化、減少起始投資； （ 2）細(xì)胞保持原初生命活動(dòng)狀態(tài)，固定化過程酶回收率高； （ 3）細(xì)胞內(nèi)酶較固定化酶穩(wěn)定性更高； （ 4）細(xì)胞內(nèi)輔因子可以自動(dòng)再生； （ 5）細(xì)胞本身含多酶體系，可催化一系列反應(yīng)； （ 6）抗污染能力強(qiáng)。 ? ① 競(jìng)爭(zhēng)性抑制 ： 與底物結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)能在酶的活性部位與酶結(jié)合，使酶促反應(yīng)速率下降 ② 非競(jìng)爭(zhēng)性抑制： 抑制劑可在酶的活性部位以外與酶結(jié)合，其結(jié)合與底物沒有 競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系 ③ 反競(jìng)爭(zhēng)性抑制 ： 抑制劑 I 僅與復(fù)合物 ES 作用生成底物 酶 抑制劑復(fù)合物 SEI ？ 從一個(gè)或多個(gè)已存在的親本出發(fā)，利用 TaqDNA 多聚酶不具有 3‘→ 5‘校對(duì)功能，并結(jié)合基因工程現(xiàn)有技術(shù)，在待進(jìn)化的酶基因的 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)中，配合適當(dāng)條件，以很低的比率向目的基因中隨機(jī)引入突變，并構(gòu)建突變庫(kù)。并憑借定向選擇（篩選）方法，獲得具有某些預(yù)期特征的進(jìn)化酶，從而排除其它方向的突變體。 ，各自具有什么特點(diǎn)？ ① KS 型不可逆抑制劑： 具有與底物類似的結(jié)構(gòu)，他們能與特 定的酶結(jié)合，它們的結(jié)構(gòu)中還帶有一個(gè)活潑的化學(xué)基團(tuán)，可以與酶分子中的必需基團(tuán)起反應(yīng)，使酶活力受到抑制 ② Kcat型不可逆抑制劑： 結(jié)構(gòu)中潛在著一種化學(xué)活性基團(tuán)，當(dāng)酶把它們作為一種底物來結(jié)合并在這一酶促催化作用進(jìn)行到一定階段以后，潛在的化學(xué)基團(tuán)被活化，成為有活性的化學(xué)基團(tuán)，并和酶蛋白活性中心發(fā)生共價(jià)結(jié)合，使酶失活 ，酶反應(yīng)器可以分為哪幾類，各自具有什么特點(diǎn)？ ① 間歇式反應(yīng)器： 先把酶和底物一次性裝入反應(yīng)器，在適當(dāng)溫度、 PH 下反應(yīng)，經(jīng)一定時(shí)間后將全部反應(yīng)物取出 。此法靈活性大，適合小批量、多品種的生產(chǎn)，并且 由于充分?jǐn)嚢?，使反?yīng)罐內(nèi)底物和產(chǎn)物濃度、 溫度 、 PH 處處相等且底物和產(chǎn)物濃度隨反應(yīng)時(shí)間而變化 生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 12 ② 半連續(xù)式反應(yīng)器： 將底物溶液緩慢加入反應(yīng)器而非一次性加入 。 此法可以避免酶反應(yīng)過程的底物抑制現(xiàn)象 ③ 連續(xù)式反應(yīng)器： 一邊連續(xù)地將底物溶液加入反應(yīng)器中，一邊連續(xù)地使反應(yīng)液以相同流量排出反應(yīng)器 。 此法便于自動(dòng)控制、反應(yīng)條件恒定、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，所以適用