【正文】 生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 1 植物細(xì)胞工程 一、 專業(yè)符號(hào) 生長素類： IAA 吲哚乙酸 IBA 吲哚丁酸 NAA 萘乙酸 2,4D 2,4二氯苯氧乙酸 細(xì)胞分裂素類： KT 激動(dòng)素 6BA（ 6BAP） 6芐基氨基嘌呤 ZT 玉米素 GA3 赤霉酸 ABA 脫落酸 醋酸酯熒光素（ FDA）染色法 DMSO 二甲基亞砜 二、名詞解釋 微室培養(yǎng)法 ： 人工制造一個(gè)小室，將單細(xì)胞培養(yǎng)在小室中的少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖形成細(xì)胞團(tuán)的方法。 看護(hù)培養(yǎng)法 ： 用一塊愈傷 組織或植物離體組織看護(hù)單細(xì)胞使其生長增殖的一種單細(xì)胞培養(yǎng)方法。 綠島法 ： 在植株上使葉面細(xì)胞產(chǎn)生突變并創(chuàng)造選擇壓力，令抗性突變細(xì)胞正常生長形成綠色斑點(diǎn)，謂之“綠島”，其為突變細(xì)胞，分散和培養(yǎng)后可得完整植株 植物原生質(zhì)體 ： 除去纖維素外壁且具有生活力的裸體植物細(xì)胞 體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑 ： 指由培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化出具胚芽、胚根、胚軸的胚狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而長成完整植株。 愈傷組織： 脫分化后的細(xì)胞，經(jīng)過細(xì)胞分裂，產(chǎn)生無組織結(jié)構(gòu)、無明顯極性的、松散的細(xì)胞團(tuán)。 細(xì)胞分化： 是指導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功 能改變或潛在發(fā)育方式改變的過程 細(xì)胞懸浮培養(yǎng) (cell suspension culture)： 將單個(gè)游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。 細(xì)胞平板培養(yǎng)： 將制備好的單細(xì)胞懸浮液，按照一定的細(xì)胞密度，與融化的瓊脂培養(yǎng)基均勻混合，并平鋪一薄層在培養(yǎng)皿底上的培養(yǎng)方法 器官發(fā)生途徑 ： 離體培養(yǎng)的組織、細(xì)胞在誘導(dǎo)條件下經(jīng)分裂和增殖再分化形成根和芽等器官的過程。有兩種發(fā)生方式：（ 1）直接發(fā)生：（具有初生分生能力的）外植體直接分化成器官的過程。（由莖尖、腋芽、原球莖、塊莖、鱗莖等器官 發(fā)生）；（ 2）間接發(fā)生：外植體（已分化的成熟組織）經(jīng)脫分化形成愈傷組織再分化形成器官的過程。 1 Ti 質(zhì)粒 ： 農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為雙鏈共價(jià)閉合的環(huán)狀 DNA 分子，有三個(gè)功能區(qū)： TDNA 區(qū)，病毒區(qū) (Vir 區(qū) )和冠癭堿代謝基因的編碼區(qū)。在 TDNA 區(qū)和 Vir 區(qū)基因的協(xié)同作用下，農(nóng)桿菌完成侵染植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)移 TDNA 的過程。 1植物細(xì)胞脫分化 ： 離體培養(yǎng)條件下，一個(gè)已分化的細(xì)胞回復(fù)到原始無分化狀態(tài)或分生組織細(xì)胞狀態(tài)或胚性細(xì)胞的狀態(tài)的過程。 三、填空題： 植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方式主要有：分批培養(yǎng)法 ，連續(xù)培養(yǎng)法，半連續(xù)培養(yǎng)法和固定化培生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 2 養(yǎng)法 誘導(dǎo)植物細(xì)胞融合的因素主要有： PEG 誘導(dǎo)； NaNO3 誘導(dǎo)；高鈣和高 PH誘導(dǎo)；高鈣和高 PH 及 PEG 結(jié)合誘導(dǎo) 一般認(rèn)為形成的器官的類型受培養(yǎng)基中兩類激素的相對(duì)濃度的控制，較高濃度的 生長素 有利于根的形成而抑制芽的形成，相反，較高濃度的 細(xì)胞分裂素 則促進(jìn)芽的形成而抑制根的形成。 植物原生質(zhì)體發(fā)育及植株再生途徑主要有：細(xì)胞壁再生；細(xì)胞分裂和生長；愈傷組織形成與分化；植株再生 制備植物原生質(zhì)體過程中，酶解去細(xì)胞壁時(shí)，為保證原生質(zhì)體的穩(wěn)定性，常加入 滲透穩(wěn)定劑 (①糖溶液系統(tǒng)：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等；②鹽溶液系統(tǒng)：包括 KCl、MgS04 和 KH2PO4 等 )。細(xì)胞質(zhì)膜穩(wěn)定劑 (葡萄糖硫酸鉀、 MES、 CaCl?2H2O、 KH2PO4 等 ). 植物原生質(zhì)體制備需要的酶：纖維素酶和果膠酶 常用的生長素有 _ 吲哚乙酸 ___、 _萘乙酸 ___、 _2,4D__ 、 _吲哚丁酸 __等，常用的細(xì)胞分裂素 __激動(dòng)素 __ 、 __6芐基氨基嘌呤 __、 _玉米素 _ 由愈傷組織再生植株有兩條途徑： 一步成苗 （ 原生質(zhì)體形成的愈傷組織直接轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上可一步成苗 ）和 兩步法成苗 （ 即首先將愈傷組織培養(yǎng)于含低濃度生長素培養(yǎng)基上，讓其增殖和調(diào)整狀態(tài)，再其轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上分化成苗 ） 四、 問答題 植物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)方法有哪幾種？ ① 液體淺層培養(yǎng)法 ： 將懸浮在培養(yǎng)液中的細(xì)胞過濾得到游離單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)，培養(yǎng)在淺層液體培養(yǎng)基中。用途：主要用來增殖細(xì)胞。特點(diǎn)：有利于有毒物質(zhì)的擴(kuò)散；有利于氣體交換；不利于定點(diǎn)觀察；單細(xì)胞生長、分裂后，難以得到單細(xì)胞系； ② 固體平板培養(yǎng)法 ： 將制備好的單細(xì)胞懸浮液，按照一定的細(xì)胞密度，與融化的瓊脂培養(yǎng)基均勻混合，并平鋪一薄層在培養(yǎng)皿底上的培養(yǎng)方法。用途 ：是為了分離單細(xì)胞無性系，研究其生理、生化的遺傳上的差異而設(shè)計(jì)的一種單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。廣泛應(yīng)用于細(xì)胞、原生質(zhì)體及融合產(chǎn)物的培養(yǎng)。特點(diǎn)：可以定點(diǎn)觀察；分離單細(xì)胞系比液體淺層培養(yǎng)容易；培養(yǎng)細(xì)胞氣體交換不暢； ③ 看護(hù)培養(yǎng) ： 指用一塊活躍生長的愈傷組織來看護(hù)單個(gè)細(xì)胞，并使其生長和增殖的方法。用途：誘導(dǎo)形成單細(xì)胞系。特點(diǎn)：效果好，易于成功；簡便易行；不能在顯微鏡下直接觀察細(xì)胞的生長過程； ④ 微室培養(yǎng) ： 人工制造一個(gè)小室，將單細(xì)胞培養(yǎng)在小室中的少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖形成細(xì)胞團(tuán)的方法。用途：主要用來觀察細(xì)胞生長、分裂、形成 細(xì)胞團(tuán)的過程。特點(diǎn)：能在顯微鏡下追蹤單細(xì)胞分裂增殖形成細(xì)胞團(tuán)的全過程；培養(yǎng)基少，營養(yǎng)和水分難以保持， pH 值變動(dòng)幅度大，培養(yǎng)細(xì)胞僅能短期分裂。 ⑤ 其它單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)： 飼養(yǎng)層培養(yǎng)基技術(shù) ：將飼養(yǎng)細(xì)胞先用射線輻射處理，然后將飼養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)細(xì)胞混合植板，經(jīng)過照射的細(xì)胞對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞起到一個(gè)飼養(yǎng)作用； 雙層濾紙植板培養(yǎng)方法。 植物細(xì)胞培養(yǎng)的植株再生步驟有哪些？ ： 離體培養(yǎng)的組織、細(xì)胞在誘導(dǎo)條件下經(jīng)分裂和增殖再分化形成根和芽等器官的過程。 （ 1）直接發(fā)生：（具有初生分生能力的）外植體直接分化成器官的過程。 （由莖尖、腋芽、生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 3 原球莖、塊莖、鱗莖等器官發(fā)生） （ 2）間接發(fā)生：外植體（已分化的成熟組織）經(jīng)脫分化形成愈傷組織再分化形成器官的過程。 (somatic embryo)： 指由培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化出具胚芽、胚根、胚軸的胚狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而長成完整植株。 由外植體經(jīng)胚狀體形成完整植株可分三個(gè)不同發(fā)育階段： 1)外植體細(xì)胞脫分化 ： 外植體發(fā)生細(xì)胞分裂，或進(jìn)而形成愈傷組織。這一階段同不定芽方式一樣。 2)胚狀體形成 ： 在植物有性生殖中，精于和卵子結(jié)合形成合子，合子進(jìn)一步發(fā)育成胚。但在組織培養(yǎng)條件下胚狀體的發(fā)育過程是： 細(xì)胞經(jīng)脫分化后，發(fā)生持續(xù)細(xì)胞分裂增殖，并依次經(jīng)過原胚期、球形胚期、心形胚期、魚雷形胚期和子葉期，進(jìn)而成為成熟的有機(jī)體。我們把由愈傷組織的類似薄壁組織細(xì)胞不經(jīng)有性過程而直接產(chǎn)生類似胚的這一結(jié)構(gòu)，稱為胚狀體。 3)胚狀體再發(fā)育成完整植株 ： 在外觀上，這種方式和不定芽均有光滑、圓形突起的形狀。 植物細(xì)胞融合過程如何？融合特點(diǎn)是什么？ 融合過程： ①凝聚作用階段，其間兩個(gè)或兩個(gè)以上的原生質(zhì)體的質(zhì)膜彼此靠近； ②在很小的局部區(qū)域質(zhì)膜緊密粘連，彼此融合，在兩個(gè)原生質(zhì)體之間細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)連續(xù)狀態(tài)，或是出現(xiàn)橋； ③由于細(xì)胞質(zhì) 橋的擴(kuò)展，融合完成，形成球形的異核體或同核體。 特點(diǎn)： 無物種限制；雜種含雙親性質(zhì) PEG 融合與電融合的基本原理是什么？各有何特點(diǎn)？ ① PEG融合 : 原理 ： PEG 是一種帶負(fù)電性的高分子化合物，在原生質(zhì)體融合中起到一種橋梁作用，可以使原生質(zhì)體凝聚。在洗脫過程中， PEG 將被洗掉，導(dǎo)致質(zhì)膜表面電荷重排。粘連的質(zhì)膜大面積緊密相連，電荷的重排隊(duì)導(dǎo)致一個(gè)原生質(zhì)體的負(fù)性電荷部位與另一原生質(zhì)體的正性電荷部位相連而導(dǎo)致融合。 優(yōu)點(diǎn)： 是融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制。缺點(diǎn)： 是融合過程繁 瑣， PEG 可能對(duì)細(xì)胞有毒害。 ② 電融合： 原理： 交流電場使原生質(zhì)體表面電荷偶極化，沿著電極排列，形成串珠 ； 施加直流電場后，形成串珠的原生質(zhì)體在質(zhì)膜接觸處發(fā)生穿孔，開始遺傳物質(zhì)的交流 優(yōu)點(diǎn)： ① 是不存在對(duì)細(xì)胞的毒害問題； ② 是融合效率高； ③ 是融合技術(shù)操作簡便。 生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 4 基因工程 一． 專業(yè)符號(hào) Tetr 四環(huán)素抗性 R/M 體系 限制與修飾現(xiàn)象 Ampr 氨芐青霉素抗性 pBR322 質(zhì)粒載體 M13 單鏈 DNA 噬菌體載體 cosmid 科斯質(zhì)粒 IPTG 異丙基 β D 硫代半乳糖苷 DNA ligase DNA 連接酶 EcoRI 限制性 酶 切位點(diǎn) host 宿主 Plasmid 質(zhì)粒 Ori 復(fù)制起始位點(diǎn) vector 載體 cDNA 反轉(zhuǎn)錄互補(bǔ) DNA southern blot DNA 印跡轉(zhuǎn)移技術(shù) MCS 多克隆位點(diǎn) 二． 名詞解釋 bioengineering ： 利用生物有機(jī)體（包括微生物和動(dòng)、植物）或其組成部分（包括器官、組織、細(xì)胞、細(xì)胞器）和組織成分（包括 DNA、 RNA、蛋白質(zhì)、酶、多糖 、抗體等），形成新的技術(shù)手段來發(fā)展新產(chǎn)品和新工藝的一種技術(shù)體系。 ： 是指按照人們的意愿，在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之轉(zhuǎn)入到原先沒有這類分子的宿主細(xì)胞內(nèi)，形成能持續(xù)穩(wěn)定繁殖的新物種。其目的是為人類提供有用產(chǎn)品及服務(wù)。 ： 利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 (TdT)轉(zhuǎn)移核苷酸的特殊功能，將同種核苷酸（ dNTP)加到 DNA分子單鏈延伸末端的 3′ OH 上。如果在目的基因兩側(cè)加 polydA，則在載體兩側(cè)加 polydT。長度一般 1040 個(gè)殘基。 接頭： 是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。 ： 大多數(shù)的細(xì)菌對(duì)于噬菌體的感染都存在一些功能性障礙，即所謂的寄主控制的限制(restriction)和修飾 (modification)現(xiàn)象，簡稱 R/M 體系。 （ 作用：一是保護(hù)自身的 DNA不受限制，二是破壞外源 DNA 使之迅速降解。 ） ： 與同裂酶對(duì)應(yīng)的一類限制酶，它們雖來源各異，識(shí)別